王漫麗

作者單位：洛陽市婦幼保健院產(chǎn)科一區(qū)，河南 洛陽 471000

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科臨床常見的內(nèi)分泌功能紊亂疾病，也是育齡期女性繼發(fā)不孕癥的常見病因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國育齡期女性中 PCOS 的發(fā)病率約為 5%～10%，且隨著女性生活壓力的劇增呈增長趨勢(shì)，可并發(fā)不孕癥、糖尿病、高血壓、甚至是子宮內(nèi)膜癌等 ，危害甚重 。 目前臨床上常用的PCOS 療法有藥物調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善胰島素抵抗等，對(duì)有強(qiáng)烈生育愿望者給予來曲唑或克羅米芬等促排卵，有一定作用，但臨床效果有限。既往報(bào)道顯示，卵巢顆粒細(xì)胞自噬可維持卵巢生殖功能，正常情況下卵巢細(xì)胞增殖和自噬、凋 亡處于平衡狀態(tài)，而卵巢顆粒細(xì)胞自噬異常激活可能是 PCOS 發(fā)生的重要機(jī)制。而抑癌基因 p53（p53）∕AMP 活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可參與調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞自噬 ，可作為 PCOS 治療藥物開發(fā)的新靶點(diǎn)。原花青素是一種生物類黃酮混合物，具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，可從藍(lán)莓葉、葡萄籽等中提取，屬于一種強(qiáng)效抗氧化劑。有研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的自噬，還可減輕 PCOS 并動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠的病理改變。但原花青素是否可通過調(diào)控 p53∕AMPK 通路抑制 PCOS 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬仍需深入研究，而探討該課題可為此類病人新藥的研究與開發(fā)提供方向，故于 2018年 4月至 2019年 6月開展如下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只雌性 SD 大鼠，無特定病原體（SPF）級(jí)，7～9周齡，體質(zhì)量范圍為 200～260 g，購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（豫）-20180001］，衛(wèi)生檢疫合格，本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 原花青素（沈陽中科藥業(yè)有限責(zé)任公司 ，國食健字 G20041220，批 次180415A，提純后純度≥98%）；來曲唑（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào) H20084597，批次 1805116）；羧甲基纖維素（CMC）（南京道斯夫生物科技有限公司）；枸櫞酸氯米芬（廣州康和制藥有限公司，批號(hào)H44021970，批次 201804102）；睪酮檢測(cè)試劑盒、促黃體生成素（FSH）檢測(cè)試劑盒、雌二醇檢測(cè)試劑盒（均購自南京建成生物研究所）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒 、單丹磺酰尸胺（MDC）染色試劑盒 、Trizol 試劑盒、蛋白提取試劑盒（均購自法國生物梅里埃公司）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液（購自深圳晶美生物科技有限公司）；兔抗鼠 p53、微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3Ⅱ（LC3Ⅱ）、AMPK、p-AMPK 單克隆抗體、酶標(biāo)記的山羊抗兔 p53、LC3 Ⅱ、AMPK、p-AMPK 多克隆抗體（均購自美國 Santa Cruz 公司）。

RT-6000 型酶標(biāo)儀（購自美國 Rayto 公司）；DSZ-70PHC 型光學(xué)顯微鏡（購自日本 Carton 公司）；5084R 型臺(tái)式離心機(jī)（購自德國 Eppendorf 公司）；Cytomics ? FC 500 型流式細(xì)胞儀（購自美國 Beckman Coulter 公司）；2720 型聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)儀（購自美國 ABI 公司）；PowerPac Basic 型電泳儀（購自美國 Bio-Rad 公司）；EPS300 型蛋白質(zhì)電泳儀（購自美國 Thermo 公司）；Trans-Blot SD 型轉(zhuǎn)膜儀（購自美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及干預(yù) 60 只成年雌性 SD 大鼠按照 1～60 自然數(shù)進(jìn)行編號(hào)，以計(jì)算機(jī)生成隨機(jī)數(shù)字表，按照隨機(jī)、均等原則分為 N 組、M 組、P 組、LD 組、MD 組 和 HD組 ，每組各10只 。 除N組外均建立PCOS 模型。建模方法：來曲唑灌服，劑量為 1 mg∕kg，溶于 1% CMC 中，連續(xù) 21 d；N 組同時(shí)灌服等容積、等濃度的基質(zhì)羧甲基纖維素，共 21 d。參照文獻(xiàn)方法驗(yàn)證模型。然后 P 組給予枸櫞酸氯米芬溶液5.21 mg∕kg 灌服，LD 組、MD 組和 HD 組分別給予 25、50、100 mg∕kg 原花青素灌服，N 組和 M 組均給予等量生理鹽水灌服，均每天 1 次，連續(xù) 24 d。

1.2.2 血清性激素水平檢測(cè) 包括睪酮、FSH、雌二醇。分別于治療前后抽取尾靜脈血 5 mL，3 500 r∕min 離心 15 min 取血清，采用化學(xué)發(fā)光法（睪酮）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（FSH、雌二醇）檢測(cè)，需按照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書操作。

1.2.3 卵 巢組 織 病理 觀察 取 0.4% 戊巴比妥 0.1 mL∕kg 腹腔注射，大鼠昏迷后取 75% 乙醇對(duì)腹部皮膚常規(guī)消毒，將腹腔打開并取出新鮮的卵巢組織。中性福爾馬林浸泡固定，梯度濃度乙醇溶液脫水，包埋并切片，HE 染色試劑盒處理，封片并以光學(xué)顯微鏡放大觀察。

1.2.4 卵巢顆粒細(xì)胞自噬率檢測(cè) 將卵巢組織取出后以生理鹽水沖洗，5 min×3 遍。將脂肪組織剔除，刺破卵泡，磷酸鹽緩沖液沖洗，200 目篩過濾。離心處理，參數(shù)：800 r∕min，5 min。取沉渣，調(diào)整細(xì)胞濃度 ，至 1×10個(gè)∕毫 升 。 MDC 染色 ，濃度 0.05 mmol∕L，37 ℃溫育 60 min 并以磷酸鹽緩沖液清洗。以流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞自噬率。

1.2.5 卵巢組織 p53、AMPK mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取卵巢組織，勻漿研磨，以試劑盒提取總核糖核酸，反轉(zhuǎn)錄。配置反應(yīng)體系，其中 p53 正向引物：5’-ACTGCTAGATTAGAGCTAGATCGA-3’，反向引物 ：5’-CTGCTAGATCGATATTAGCTATAGCGAT-3’；AMPK 正向引物：5’-CTCGATAGGATCGATAGATCGAAC-3’，反向引物 ：5’-CTCGATATGATCTAGTATAGATCAGA-3’；β 肌動(dòng)蛋白（β -actin）：正向引物 ：5’-CTGCTCGATAGATCGATAGCTAGC-3’，反向引物：5’-CTGCTGATAGCTAGCTAGGGATTC-3’。 以 PCR 儀反應(yīng)，條件：95 ℃、10 min，40 個(gè)循環(huán)：95 ℃、10 s→60 ℃、20 s→72 ℃、20 s，60 ℃、5 min。取產(chǎn)物電泳，分析并計(jì)算目的基因的表達(dá)量，即 2。

1.2.6 卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ、AMPK 蛋白表達(dá)及 p-AMPK 檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法，取卵巢組織勻漿研磨，滅活并以磷酸鹽緩沖液沖洗。提取總蛋白，定量后上樣電泳，脫脂奶粉封閉，室溫下孵育 1 h。滴加一抗，4 ℃下孵育過夜；磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加二抗，37 ℃下孵育 2 h，再次以磷酸鹽緩沖液沖洗。以 DAB 顯色，以蒸餾水終止顯色反應(yīng)，暗室曝光、顯影和定影。拍照掃描，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量，即目的蛋白與內(nèi)參（β-actin）的比值。

2 結(jié)果

2.1 治療前后血清性激素水平對(duì)比

N 組、M 組、P組、LD 組、MD 組和 HD 組分別有 1 只、3 只、2 只、1只、1 只和 1 只大鼠非正常原因死亡，均剔除。各組治療前后血清睪酮、雌二醇和 FSH 對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.001），治療后 N 組血清性激素水平與治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），M 組血清睪酮、FSH 水平均升高，雌二醇水平下降（

P

＜0.05）；治療前后 M 組、P 組、LD 組、MD 組和 HD 組血清睪酮、FSH水平均高于 N 組，雌二醇水平均低于 N 組（

P

＜0.05）；治療后 P 組、LD 組、MD 組和 HD 組血清睪酮、FSH 水平均低于 M 組，雌二醇水平均高于 M 組（

P

＜0.05）；治療后 LD 組血清睪酮、FSH 水平均高于 P組，雌二醇水平低于 P 組（

P

＜0.05）；MD 組血清性激素水平與P 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；HD 組血清睪酮、FSH 水平均低于P組 ，雌二醇水平高于P組（

P

＜0.05）；LD 組、MD 組和 HD 組血清性激素水平均呈劑量依賴性，每兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。見表1。

2.2 卵巢組織病理學(xué)變化觀察

N 組卵泡排列整齊，大小均勻，結(jié)構(gòu)清晰，顆粒細(xì)胞規(guī)整，可達(dá) 8～9層，大多均可見卵丘；M 組卵泡排列嚴(yán)重紊亂，大小明顯不一，結(jié)構(gòu)極度混亂，顆粒細(xì)胞紊亂且排列稀疏，細(xì)胞層僅 1～2 層，僅有極少量黃體組織；P 組卵泡排列稍顯紊亂，大小不均，結(jié)構(gòu)輕微混亂，顆粒細(xì)胞排列紊亂且輕微稀疏，顆粒細(xì)胞 5～6 層，有黃體組織；LD 組卵泡排列紊亂，大小不均，結(jié)構(gòu)混亂，顆粒細(xì)胞排列明顯紊亂且排列稀疏，顆粒細(xì)胞僅 3～4 層，有少量黃體組織；MD 組與 P 組相近；HD 組卵泡排列稍顯紊亂，基本均勻，少部分結(jié)構(gòu)不清，顆粒細(xì)胞大多相對(duì)規(guī)整，可達(dá) 7～8 層，可見卵丘。

表1 各組大鼠治療前后血清性激素水平對(duì)比

2.3 卵巢顆粒細(xì)胞自噬率對(duì)比

N 組、M 組、P 組、LD 組、MD 組、HD組卵巢顆粒細(xì)胞自噬率分別為（7.12±0.56）% 、（18.93±3.12）% 、（11.20±1.82）% 、（13.45±2.10）% 、（11.08±1.79）% 、（9.86±1.05）%（

F

=41.368，

P

＜0.001）。與 N 組比較其余五組均升高，與M 組比較，P 組、LD 組、MD 組和 HD 組均下降，與 P 組卵巢顆粒細(xì)胞自噬率比較，LD 組升高、LD 組下降，與 LD 組比較，MD 組、HD 組卵巢顆粒細(xì)胞自噬率均下降，且 HD 組低于 MD 組（

P

＜0.05）。

2.4 卵巢組織 p53、AMPK mRNA 表達(dá)對(duì)比

各組卵巢組織 p53 mRNA 表達(dá)對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.001）；各組卵巢組織 AMPK mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表2。

2.5 卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ、AMPK 蛋白表達(dá)及 p-AMPK 對(duì)比

各組卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)及 p-AMPK 對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.001）；各組卵巢組織 AMPK 蛋白表 達(dá)差異 無 統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義（

P

＞0.05）。見表3、圖1。

3 討論

PCOS 常見的病因有下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常、代謝紊亂、腎上腺功能失常及遺傳等，可引起被膜纖維化增厚，導(dǎo)致卵巢囊性增大、影響正常排卵。目前人們對(duì)該病的具體機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺，且臨床治療方案多缺乏特異性，而新藥研究也缺乏治療靶點(diǎn)，因此采用新的藥物通過已知的途徑發(fā)揮治療作用是目前重要課題。卵巢顆粒細(xì)胞自噬與卵細(xì)胞的發(fā)育、排出等生理過程均有密切關(guān)聯(lián)，細(xì)胞自噬與細(xì)胞生物學(xué)改變有密切關(guān)系。而抑制卵巢顆粒細(xì)胞自噬是當(dāng)前針對(duì) PCOS 新藥研究的熱點(diǎn)。

表2 各組大鼠卵巢組織 p53、AMPK mRNA 表達(dá)對(duì)比

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組大鼠卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ、AMPK蛋白表達(dá)及 p-AMPK

表3 各組大鼠卵巢組織 p53、LC3 Ⅱ、AMPK 蛋白表達(dá)及 p-AMPK 對(duì)比

本研究中，P 組、LD 組、MD 組和 HD 組治療后血清性激素水平均顯著改善，M 組治療后血清性激素水平均顯著惡化，N 組均無明顯變化，且治療后 HD組血清性激素水平改善最理想，可知原花青素和枸櫞酸氯米芬均有助于改善 PCOS 大鼠血清性激素水平。睪酮主要由卵巢、腺外組織、腎上腺皮質(zhì)轉(zhuǎn)化，在 PCOS 發(fā)病過程中，睪酮顯著升高，主要原因是卵泡雄激素濃度過高，可促進(jìn)黃體細(xì)胞內(nèi)雄激素轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮，抑制卵巢的正常發(fā)育；雌二醇主要來源是卵巢，在 PCOS 發(fā)生過程中可導(dǎo)致雌激素不足，抑制黃體細(xì)胞內(nèi)雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，因而其水平較低；FSH 主要由垂體前葉促性腺激素細(xì)胞分泌，可刺激顆粒細(xì)胞增生和卵泡生長發(fā)育，在PCOS 中 FSH 的水平顯著升高，且對(duì) PCOS 病情有評(píng)估作用。因此在 PCOS 治療中應(yīng)積極調(diào)控血清性激素水平。原花青素是目前公認(rèn)的高效自由基清除劑和天然抗氧化劑，常用于抗氧 化應(yīng)激損傷治療，在 PCOS 中的作用報(bào)道尚少。結(jié)合上述分析和本研究結(jié)果，推測(cè)原花青素可調(diào)控 PCOS 大鼠血清性激素水平，且高濃度的原花青素對(duì)其調(diào)控作用明顯優(yōu)于枸櫞酸氯米芬，顯示出良好的挖掘價(jià)值。在本研究 HE 病理學(xué)變化觀察中顯示，M 組卵巢組織有嚴(yán)重的病理改變，P 組、LD 組、MD 組和 HD 組均有所減輕，且 HD 組與 N 組最為接近，提示原花青素可減輕 PCOS 大鼠卵巢組織的病理學(xué)改變，且呈劑量依賴性。因此原花青素不僅可調(diào)控 PCOS 大鼠血清性激素水平，還可減輕卵巢組織病理改變。

此外，本研究關(guān)于卵巢顆粒細(xì)胞自噬率的對(duì)比結(jié)果中顯示，N 組＜HD 組＜MD 組∕P 組＜LD 組＜M 組，表明原花青素可抑制 PCOS 大 鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬，且其作用呈劑量依賴性。在基因及蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果中顯示，原花青素可上調(diào) p53 基因及蛋白表達(dá)，抑制 AMPK的磷酸化 ，控 制 LC3 I 向 LC3 Ⅱ 轉(zhuǎn)化，推 測(cè)該藥物很可能是通過上述 途徑實(shí)現(xiàn)抑制PCOS 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬的。成熟卵泡的顆粒細(xì)胞是卵泡最重要的單元，顆粒細(xì)胞增殖、分化在卵泡發(fā)育過程中均有參與，且可促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育與成熟。顆粒細(xì)胞是否凋亡可直接影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，而自噬與凋亡關(guān)系密切，有研究表明自噬是凋亡的引導(dǎo)機(jī)制，而 LC3 I 向 LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)化是卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生自噬的重要表現(xiàn)。 p53∕AMPK 信號(hào)通路在自噬過程中也有調(diào)控作用，其中p53 基因與蛋白可負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，還可通過轉(zhuǎn)錄依賴性途徑增加 AMPK 蛋白的磷酸化水平進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬。研究顯示，卵巢顆粒細(xì)胞自噬過程中，p53∕AMPK 通路不僅可參與直接調(diào)控，還可調(diào)控 LC3 I 向 LC3 Ⅱ的轉(zhuǎn)化間接影響細(xì)胞自噬。根據(jù)本研究結(jié)果和上述分析，推測(cè)原花青素可通過調(diào)控 p53∕AMPK 通路，上調(diào) p53.基因及蛋白表達(dá)，抑制AMPK 的磷酸化，控制 LC3 I 向 LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)化進(jìn)而抑制卵巢顆粒顆粒細(xì)胞自噬的。

綜上所述，在 PCOS 大鼠中給予原花青素灌服可改善血清性激素水平，減輕卵巢病理改變，抑制卵巢顆粒細(xì)胞自噬，且呈劑量依賴性，中劑量原花青素的效果與枸櫞酸氯米芬均相近，而高劑量原花青素的效果均最佳，推測(cè)很可能與調(diào)控 p53∕AMPK通路，上調(diào) p53 基因及蛋白表達(dá)，抑制 AMPK 的磷酸化，控制 LC3 I 向 LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)化有關(guān)。但其具體作用機(jī)制及在臨床治療中應(yīng)用的可行性仍需要進(jìn)一步探討，可作為進(jìn)一步的研究方向。