楊嘉陵 ，谷成杰 ，歐國(guó)東

作者單位：1 重慶市雙橋經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400900；2 重慶市巴南區(qū)接龍中心醫(yī)院藥劑科，重慶 401344；3 重慶市大足區(qū)第二人民醫(yī)院藥劑科，重慶 402368

腎小管損傷是各種急慢性腎病的主要病理特征，可見(jiàn)于腎臟因缺氧、中毒、缺血再灌注損傷、糖尿病腎病等，腎小管上皮細(xì)胞是腎小管損傷的直接靶細(xì)胞。研究藥物對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制對(duì)腎損傷病人具有重要意義。

脂多糖可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞損傷，脂多糖誘導(dǎo)的腎損傷模型為大多研究者所采用。研究表明，β 欖香烯（β-elemene）是具有廣譜抗腫瘤效果，在非腫瘤疾病中具有抗氧化損傷、抗凝血、抗血栓和延緩白內(nèi)障的作用，且毒副作用小。研究還發(fā)現(xiàn)，β 欖香烯可抑制腎小球系膜細(xì)胞纖維化，并抑制炎癥反應(yīng)。但是 β 欖香烯在脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）中的影響和機(jī)制尚不清楚。

本研究于 2018年 1月至 2019年 2月以脂多糖誘導(dǎo) HK-2 產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷為模型，以 β 欖香烯處理的方法來(lái)檢測(cè) β 欖香烯對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的 HK-2損傷和凋亡的影響和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

腎小管上皮細(xì)胞系 HK-2（購(gòu)自 ATCC）；DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶Trypsin（購(gòu)自 Gibco 公司）；脂多糖、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司）；β 欖香烯（購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司）；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）；Bcl-2 相 關(guān) X（Bax）抗體、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體、核因子 E2相關(guān)因子 2（Nrf2）抗體、血紅素氧合酶-1（HO-1）抗體和抗 β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（購(gòu)自英國(guó) Abcam公司）；活性氧自由基（ROS）和丙二醛檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自上海碧云天技術(shù)有限公司）；流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó) BD 公司）；流式細(xì)胞儀（購(gòu)自美國(guó) BD 公司），顯微鏡、酶標(biāo)儀（購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司），BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 將腎小管上皮細(xì)胞HK-2 培養(yǎng)于含 10 % FBS、1% 青-鏈霉素的 DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% 二氧化碳、濕度 95% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合為一層時(shí)，消化傳代。

NC 組：空白對(duì)照培養(yǎng)基不加藥物；脂多糖組：培養(yǎng)基中加入終濃度 1 μg∕L 的脂多糖，培養(yǎng) 24 h；脂多糖+β 欖香烯組：培養(yǎng)基中加入終濃度 1 μg∕L 的脂多糖培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，然后加入含不同終濃度 β 欖香烯（2.5 mg∕L、5.0 mg∕L 和 10.0 mg∕L）的 DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測(cè)細(xì)胞存活率 待“1.2.1”分組的 HK-2 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞并進(jìn)行消化，以每孔2×l0個(gè)細(xì)胞接種于 96 孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至 24 h、48 h、72 h 和 96 h 時(shí)，進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)，每孔加入 20 μL MTT 溶液，培養(yǎng) 4 h 后棄上清，再每孔加入 150 μL DMSO，室溫震蕩 5 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A 值（490 nm），計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 經(jīng)脂多糖或∕和 β 欖香烯處理后各組細(xì)胞，以 2×10個(gè)∕孔接種于 6孔板中，培養(yǎng) 48 h ，棄培養(yǎng)液，消化，離心收集細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，室溫避光 20 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞（NC 組、脂多糖組、脂多糖+β 欖香烯組）進(jìn)行收集，加入 RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎，收集蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將每個(gè)樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），以 β-actin 為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.2.5 檢測(cè)細(xì)胞中 GSH-PX、SOD、丙二醛和 ROS 含量 根據(jù)“1.2.4”的方法收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，根據(jù) GSH-PX、SOD、丙二醛和 ROS試劑盒的說(shuō)明書要求進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞裂解上清中各指標(biāo)含量。

2 結(jié)果

2.1 β 欖香烯可提高脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞HK-2 存活率

結(jié)果顯示，與 NC 組［24～96 h 細(xì)胞存活率分別為（100.00±3.56），（100.00±4.78），（100.00±3.17），（100.00±5.64），周期蛋白依賴性激酶（CDK）4含量（0.79±0.09），CDK6 含量（0.64±0.05）］相比，脂多糖組的 HK-2 細(xì)胞存活率在 24～96 h［（73.65±3.39），（68.24±5.93），（63.52±3.10），（58.27±4.05）］顯著下降 ，CDK4（0.23±0.03）和 CDK6 表達(dá)量（0.41±0.05）顯著下降（

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001）；與脂多糖組相比 ，β 欖香烯 2.5 mg∕L+ 脂多糖組［（78.42±3.39），（74.63±4.29），（65.39±4.18），（62.37±4.14）］、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組［（89.43±5.67），（79.64±6.27），（73.64±4.29），（65.37±4.12）］和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+脂多糖組［（87.24±5.68），（78.69±5.42），（72.13±4.09），（63.27±4.25）］的細(xì)胞存活率增高 ，CDK4［（0.42±0.04），（0.51±0.05），（0.65±0.07）］和CDK6 表達(dá)量［（0.51±0.04），（0.56±0.04），（0.62±0.05）］顯著增多（

P

=0.030、0.016、0.003、0.000、0.034、0.023；

P

=0.009、0.000、0.000、0.000、0.008、0.014；

P

=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.002），見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度 β 欖香烯對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞存活

2.2 β 欖香烯抑制脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞HK-2 凋亡

流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示 ，與 NC 組［（4.86±0.62）；（0.64±0.05）；（0.78±0.08）］相比，脂多糖組（27.34±2.68）的 HK-2 細(xì)胞凋亡率升高，促凋亡蛋白 Bax 表達(dá)量（0.83±0.08）升高，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達(dá)（0.37±0.04）降低（

P

＜0.001、

P

＜0.001、

P

＜0.001）；與脂多糖組相比，β欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+脂多糖組的細(xì)胞凋亡率［（25.64±2.89），（23.67±2.24），（18.64±2.08）］和 Bax表 達(dá) 量［（0.77±0.06），（0.68±0.06），（0.65±0.06）］逐漸降低 ，Bcl-2 表達(dá)量［（0.46±0.04），（0.59±0.07），（0.62±0.07）］逐漸升高（

P

=0.043、0.026、0.019；

P

=0.005、0.001、0.001；

P

=0.001、0.000、0.000），見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度β欖香烯對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；B為蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

2.3 β 欖香烯促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的 HK-2 細(xì)胞產(chǎn)生GSH-PX 和 SOD

與NC組［（82.91±6.18），（36.76±2.68）］相比 ，脂多糖組的 HK-2 細(xì)胞中 GSH-PX（57.23±3.17）和 SOD（21.13±1.34）水平 降低（

P

＜0.001、

P

=0.003）；與 脂 多 糖組相比 ，β 欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+ 脂多糖組 HK-2 細(xì)胞中 GSH-PX［（65.37±2.54），（70.26±4.36），（72.46±3.64）］和 SOD［（25.69±1.67），（27.67±1.65），（28.96±1.85）］水平增高（

P

=0.039、0.017、0.009；

P

=0.025、0.018、0.012）。

2.4 β 欖香烯對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞丙二醛和 ROS 的影響

與 NC 組［（1.00±0.06），（1.00±0.09）］相比，脂多糖組的 HK-2 細(xì)胞中丙二醛（1.62±0.13）和 ROS（3.34±0.32）水平升高（

P

=0.001、

P

＜0.001）；與脂多糖組相比 ，β 欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組 、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組 和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+ 脂多糖組 HK-2 細(xì)胞中丙二醛［（1.43±0.08），（1.35±0.11），（1.31±0.09）］和 ROS［（2.34±0.21），（1.85±0.12），（1.61±0.11）］水平逐漸降低（

P

=0.024、0.026、0.012；

P

=0.006、0.000、0.000）。

2.5 β 欖香烯對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的影響

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示 ，與 NC 組［（0.79±0.06），（0.62±0.05）］相比 ，脂多糖組的 HK-2 細(xì)胞中 Nrf2（0.33±0.04）和 HO-1（0.27±0.03）表達(dá)水平顯著降低（

P

＜0.001、

P

＜0.001）；與脂多糖組相比，β 欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+脂多糖組 HK-2 細(xì)胞中 Nrf2［（0.42±0.04），（0.57±0.06），（0.63±0.06）］和 HO-1［（0.35±0.03），（0.43±0.05），（0.45±0.05）］表達(dá)水平逐漸升高（

P

=0.018、0.007、0.000；

P

=0.033、0.002、0.000），見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度 β 欖香烯對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞 Nrf2∕HO-1 信號(hào)通路的影響

3 討論

腎小管細(xì)胞損傷（包括細(xì)胞壞死和凋亡）引起細(xì)胞功能紊亂導(dǎo)致腎損傷，慢性進(jìn)展性腎損傷通常會(huì)進(jìn)展至腎纖維化或腎衰竭。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性分子 ROS 或脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛通常引起細(xì)胞凋亡，而氧化應(yīng)激及其引發(fā)的細(xì)胞凋亡是多種腎病的致病因素。

脂多糖可導(dǎo)致包括肺、肝和腎等多種細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞炎癥反應(yīng)引起急性損傷。脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型相對(duì)簡(jiǎn)單，也被大多數(shù)研究者認(rèn)可。本研究通過(guò)建立腎小管上皮細(xì)胞 HK-2 的脂多糖模型，發(fā)現(xiàn)脂多糖可抑制 HK-2 細(xì)胞存活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞中 GSH-PX 和 SOD 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞大量產(chǎn)生丙二醛和 ROS，造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

β 欖香烯是中藥溫莪術(shù)中的一種萜類抗腫瘤活性成分，β-欖香烯可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞凋亡和抑制膀胱癌。β 欖香烯（20、40 mg∕L）通過(guò) β - 連環(huán)蛋白（β -catenin）的失活下調(diào) Wnt∕β -catenin 信號(hào)通路，從而抑制促炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥中起保護(hù)作用。β欖香烯（50 μmol∕L）還可通過(guò)減輕血管氧化應(yīng)激水平和抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕 ApoE-∕-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的大小和增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性。β 欖香烯（80、120、160 mg∕L）還可通過(guò)抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和纖維連接蛋白（FN）的表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的纖維化。β 欖香烯對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的影響還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，2.5 mg∕L、5 mg∕L 和 10 mg∕L 的 β欖香烯可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的 HK-2 凋亡，提高細(xì)胞存活率，減輕脂多糖誘導(dǎo)的 HK-2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，以上述研究結(jié)果類似，且所需 β 欖香烯的濃度相對(duì)低一些。

Nrf2∕HO-1 信號(hào)通路是人體內(nèi)重要的內(nèi)源性防御體系，在多種組織（心、腦、肝、腎和神經(jīng)組織）中可被激活，是抗氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵因子。當(dāng)機(jī)體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2 可誘導(dǎo) HO-1 過(guò)表達(dá)，阻止氧化反應(yīng)、抗炎和抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，脂多 糖 抑制 HK-2 細(xì) 胞中 Nrf2 和 HO-1 的表達(dá) ，抑 制 Nrf2∕HO-1 信號(hào)通路 ，而 β 欖香烯可促進(jìn)Nrf2 和 HO-1 的表達(dá)，說(shuō)明 β 欖香烯可能通過(guò)激活Nrf2∕HO-1 信號(hào)通路，保護(hù) HK-2 細(xì)胞減輕脂多糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的 HK-2 中，β 欖香烯可能通過(guò)激活 Nrf2∕HO-1 信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。β 欖香烯在腎損傷等腎病中可能具有治療作用。本研究只進(jìn)行了體外細(xì)胞的研究，后續(xù)將根據(jù)條件進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)模型試驗(yàn)，進(jìn)一步確認(rèn) β 欖香烯在治療腎損傷等腎病的臨床意義。