張芳，楊寶軍，王婧華

（平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院 病理科，河南 平頂山467009）

肺癌是目前臨床死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌約占全部肺癌的80%以上，而在非小細(xì)胞肺癌中，肺腺癌最為常見，是醫(yī)學(xué)界研究熱點(diǎn)。肺腺癌臨床表現(xiàn)無明顯特異性，但具有獨(dú)特分子學(xué)特征。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是一種原癌基因C－erbB－1表達(dá)產(chǎn)物，其異常表達(dá)及基因突變與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、化療抗性、新生血管生成及預(yù)后密切相關(guān)［1］。在免疫表型方面，肺腺癌具有一些特異分子標(biāo)記物，Ki67屬于腫瘤增殖相關(guān)抗原，參與腫瘤細(xì)胞增殖及調(diào)控；而P53蛋白是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞DNA修復(fù)、周期調(diào)控、細(xì)胞分化和凋亡等生物學(xué)功能相關(guān)，具有廣譜腫瘤抑制作用和反式激活功能［2］。基于此，本研究選取我院收治的肺腺癌患者160例，分析肺腺癌EGFR基因突變與Ki67、P53蛋白水平的相關(guān)性，旨在為臨床治療及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年7月至2019年6月我院收治的160例肺腺癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理均診斷為肺腺癌；確診前未接受放化療；患者及家屬知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肝腎等臟器功能異常；合并其他惡性腫瘤；確診前接受靶分子治療；精神系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)疾??；難以配合檢查。其中男86例，女74例；年齡30～81歲，平均年齡（58.96±7.11）歲；分化程度：低分化54例，中分化58例，高分化48例。檢測(cè)肺腺癌EGFR基因突變情況，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將其分為EGFR陽性組和EGFR陰性組各80例。兩組的性別、年齡、分化程度等一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 EGFR基因19、21位點(diǎn)突變檢測(cè) 采用EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20170202H，海吉利生物有限公司），采用Taq man－ARMS法檢測(cè)EGFR基因19、21位點(diǎn)突變情況，EGFR基因19、21位點(diǎn)突變?yōu)殛栃?，無基因突變?yōu)殛幮浴?/p>

1.2.2 Ki67、P53蛋白表達(dá)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)步驟如下：（A）常規(guī)HE染色實(shí)驗(yàn)：常規(guī)石蠟標(biāo)本切片，切片厚度＜3μm；干烤箱內(nèi)100℃烤片固定40 min；切片室溫靜置60 min，并在二甲苯內(nèi)浸泡2次，10 min／次，依次于濃度100%、95%、85%、75%、50%乙醇內(nèi)浸泡5 min，采用蒸餾水孵育5 min后PBS緩沖液孵育5 min；蘇木素染色5 min，再用自來水沖洗2 min；分化液分化，2次振蕩，停留15 s后再次用自來水流水洗滌；流水沖洗返藍(lán)，沖洗時(shí)間2 min；伊紅染色，振蕩3下；不同濃度酒精脫水，5 min／次；風(fēng)干，中性樹膠封固，采用顯微鏡觀察。（B）免疫組化法：石蠟標(biāo)本切片，切片厚度＜3μm；切片室溫靜置60 min，二甲苯內(nèi)浸泡2次，10 min／次，依次于濃度100%、95%、85%、75%、50%乙醇內(nèi)浸泡5 min，蒸餾水孵育5 min后PBS緩沖液孵育5 min；滴加3%H2O2，采用濕盒孵育10 min，清洗；PBS緩沖液再次浸泡，共3次，5 min／次；切片置入檸檬酸緩沖液，連同容器置于高壓鍋內(nèi)加熱至沸騰，維持8 min，后自然降至室溫；PBS緩沖液浸泡2次，5 min／次；滴加已稀釋的一抗，4℃過夜，PBS緩沖液沖洗2次，10 min／次；滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS緩沖液沖洗2次，10 min／次；滴加新鮮DAB工作液，采用濕盒孵育，顯微鏡下觀察染色程度，控制反應(yīng)時(shí)間，判斷染色結(jié)束后，緩沖液浸泡3次，5 min／次；蘇木素復(fù)染3 min，沖洗多余染液；1%鹽酸酒精浸泡數(shù)秒，清洗切片；不同濃度酒精脫水，5 min／次，置入二甲苯浸泡，10 min／次，共2次；擦去多余液體，中性樹膠固定，蓋玻片封片，顯微鏡下觀察。（C）Ki67、P53蛋白結(jié)果判讀：陽性：細(xì)胞核呈棕黃色，根據(jù)細(xì)胞核染色程度分為1分（淡黃色）、2分（棕黃色和黃色）、3分（棕黑色）；根據(jù)染色細(xì)胞所占同類細(xì)胞數(shù)比例：＜10%為0分，10%～30%為1分，31%～70%為2分，＞70%為3分。Ki67蛋白：≥3分為高表達(dá)，＜3分為低表達(dá)；P53蛋白：≥3分為高表達(dá)，＜3分為低表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo)①觀察兩組的Ki67、P53蛋白水平；②分析EGFR基因突變與Ki67、P53蛋白水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組的Ki67、P53蛋白水平比較Ki67陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，P53陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，EGFR陽性組的Ki67、P53高表達(dá)率分別為48.75%、52.50%，高于EGFR陰性組的21.25%、25.00%（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組的Ki67、P53蛋白水平比較［n（%）］

2.2 相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析顯示，EGFR基因突變與Ki67蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.148，P＝0.002），與P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.121，P＝0.001）。

3 討論

肺腺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均極高的惡性腫瘤之一［3］。EGFR屬于受體型酪氨酸激酶erbB／HER家族成員，與其配體結(jié)合后，可造成受體自身磷酸化，活化PI3／AKT、RAS／MAPK及磷脂酶C－γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及腫瘤血管形成等過程［4］。相關(guān)研究［5］表明，肺腺癌發(fā)生、進(jìn)展與EGFR位點(diǎn)基因突變密切相關(guān)，并影響臨床治療方案制定及預(yù)后效果。目前，針對(duì)EGFR基因突變肺腺癌患者，臨床采用EGFR酪氨酸酶抑制劑治療，可顯著延長(zhǎng)生存期，表明EGFR基因突變屬于肺腺癌進(jìn)展驅(qū)動(dòng)因子［6］。Ki67蛋白是分布于增殖細(xì)胞中的非組蛋白性核抗原，在人增殖細(xì)胞G1、G2、S、M期表達(dá)，G0期低表達(dá)或無表達(dá)，其表達(dá)程度可反映腫瘤增殖率，在多數(shù)惡性腫瘤進(jìn)展期，Ki67呈高表達(dá)［7］。P53蛋白是細(xì)胞生長(zhǎng)周期中的一種負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)等重要生物學(xué)功能相關(guān)，通常認(rèn)為P53過表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)及不良預(yù)后有一定關(guān)聯(lián)［8］。本研究結(jié)果顯示，EGFR陽性組的Ki67、P53高表達(dá)率與EGFR陰性組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ki67、P53蛋白水平與EGFR基因突變呈正相關(guān)（P＜0.05），表明判斷Ki67、P53表達(dá)能評(píng)估EGFR基因突變狀況，對(duì)臨床治療肺腺癌及預(yù)后評(píng)估具有重要作用。

綜上所述，肺腺癌EGFR基因突變與Ki67、P53蛋白水平具有相關(guān)性，Ki67、P53蛋白表達(dá)能夠有效評(píng)估肺腺癌基因突變程度、增殖活性及預(yù)后效果，為臨床治療及預(yù)后評(píng)估提供一定的依據(jù)。