卞麗霞 劉佩 黃雯 俞軍 蒲加澤

胃癌(gastric cancer)是全球范圍內(nèi)癌癥導(dǎo)致死亡的第三大原因[1]。據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，胃癌已成為中國(guó)第二大常見(jiàn)癌癥，2015年約有498 000例患者死亡[2]，而且大多數(shù)患者被診斷時(shí)已是晚期，導(dǎo)致胃癌患者的5年生存率<25%[3]。許多植物中的化學(xué)物質(zhì)會(huì)對(duì)癌癥產(chǎn)生一定的抑制作用，白藜蘆醇(Resveratrol，RES)就是其中之一。白藜蘆醇是一種非黃酮類(lèi)多酚化合物，是許多植物受到外界刺激后產(chǎn)生的一種抗毒素，白藜蘆醇除對(duì)衰老[4,5]、糖尿病[6,7]、心血管疾病[7]等有作用外，還對(duì)肺癌[8]、前列腺癌[9]、肝癌[10]、胃癌[11]等癌癥有一定的抗瘤活性。MicroRNA(miRNA，miR)是長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的非編碼短RNA分子，在人類(lèi)癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，而且有可能被用作癌癥的潛在治療靶點(diǎn)[12]。據(jù)研究報(bào)道，有多種miRNA參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展，且部分miRNA也可以作為癌癥診斷的分子標(biāo)志物[13,14]。miR-491在多種癌癥中能夠調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲和耐藥性[15,16]，且miR-491對(duì)胃癌細(xì)胞也有一定的抑制作用[17,18]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和人胃上皮細(xì)胞株GES-1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與主要儀器 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑盒均購(gòu)于賽默飛；TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于連橋生物科技有限公司；SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)于瑞諾德生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于科敏生物科技有限公司。Thermo酶標(biāo)儀購(gòu)于益奧柏科貿(mào)有限公司；Smartzoom 5顯微鏡購(gòu)于普瑞賽斯儀器有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株SGC-7901和胃上皮細(xì)胞株GES-1在37℃、5% CO2的條件下置于含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SGC-7901細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。SGC-7901細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)將上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) SGC-7901細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后使用CCK-8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活力，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光光度值，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔并設(shè)置空白對(duì)照。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞以2×104個(gè)/室的密度接種于包覆有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室，在下室中加入含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)基作為引誘劑。24 h后擦拭掉上室未發(fā)生遷移的細(xì)胞，使用4%多聚甲醛固定下室中的細(xì)胞并使用0.1%的結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 使用Trizol試劑盒提取SGC-7901細(xì)胞內(nèi)的總RNA，使用TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA，使用SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃，5 min；95℃，20 s；60℃，30 s。此過(guò)程共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所有引物均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白藜蘆醇處理后胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖活力變化情況。白藜蘆醇濃度>50 μmol/L時(shí)，SGC-7901細(xì)胞的增殖活力受到顯著抑制(P<0.05)；隨白藜蘆醇濃度增加，SGC-7901細(xì)胞的增殖活力受到的抑制也顯著增加。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，白藜蘆醇(50 μmol/L)處理后SGC-7901細(xì)胞的遷移能力受到顯著抑制(P<0.001)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 白藜蘆醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移數(shù)目的影響 個(gè),

圖1 白藜蘆醇抑制SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移;A SGC-7901細(xì)胞增殖活力;B SGC-7901細(xì)胞遷移能力

2.2 白藜蘆醇對(duì)miR-491表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于GES-1細(xì)胞，胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)miR-491的表達(dá)量顯著降低(1.00±0.04 vs 0.57±0.04，P<0.001)；SGC-7901經(jīng)過(guò)白藜蘆醇(50 μmol/L)處理后，細(xì)胞內(nèi)miR-491的表達(dá)量顯著上調(diào)(1.00±0.03 vs 1.52±0.03，P<0.001)。

2.3 miR-491影響SGC-7901增殖和遷移 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-491 mimics脂質(zhì)體的SGC-7901細(xì)胞內(nèi)miR-491的表達(dá)相較于轉(zhuǎn)染miR-NC脂質(zhì)體的SGC-7901細(xì)胞顯著上調(diào)(1.00±0.01 vs 1.62±0.06，P<0.001)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-491 mimics脂質(zhì)體后，SGC-7901細(xì)胞的增殖活力相較于轉(zhuǎn)染miR-NC脂質(zhì)體的SGC-7901細(xì)胞受到顯著抑制(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于轉(zhuǎn)染miR-NC脂質(zhì)體的SGC-7901細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-491 mimics脂質(zhì)體的SGC-7901細(xì)胞遷移能力受到顯著抑制(P<0.001)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 miR-491對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移數(shù)目影響

圖2 miR-491影響SGC-7901增殖和遷移;A miR-491增殖活力;B SGC-7901遷移能力

3 討論

白藜蘆醇最早是從白藜蘆根部分離出的多酚化合物，目前在桑葚、葡萄、花生等植物中也有發(fā)現(xiàn)[19,20]。有文獻(xiàn)報(bào)道，白藜蘆醇具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗哮喘的作用[7,20,21]。CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一定劑量的白藜蘆醇對(duì)胃癌SGC-7901的增殖和遷移都有一定的抑制作用，與已報(bào)道的結(jié)果一致。miR-491在乳腺癌、胃癌、肺癌和結(jié)直腸癌等癌癥[22,23]中起重要的抑癌作用。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-491在胃癌SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)，且SGC-7901中miR-491的表達(dá)量在經(jīng)過(guò)白藜蘆醇的處理后顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)染miR-491 mimics脂質(zhì)體后，胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖和遷移都受到一定的抑制作用。表明白藜蘆醇有可能通過(guò)上調(diào)miR-491的表達(dá)來(lái)抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖和遷移。

據(jù)報(bào)道，miRNA影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展主要是通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[24]。ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-491存在5373個(gè)可能的下游靶基因，Wang等[25]研究表明，miR-491可以通過(guò)靶向CRYAB抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移并增強(qiáng)其化療敏感性。通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知，非洲爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白2(TPX2)的表達(dá)與胃癌的預(yù)后相關(guān)[26]，而且分析發(fā)現(xiàn)TPX2也是miR-491的下游靶基因之一，因此我們推測(cè)白藜蘆醇對(duì)胃癌SGC-7901增殖和遷移的抑制作用有可能是通過(guò)miR-491/TPX2分子軸實(shí)現(xiàn)的，但這需要進(jìn)一步研究。