楊正祥 謝陸莉 鄧琳 王瑜

正畸牙齒時(shí)移動(dòng)的基礎(chǔ)是牙周組織進(jìn)行改建，在該過(guò)程中牙周膜發(fā)揮橋梁的重要作用，其最先能夠感受到外界的作用力并且將該力傳導(dǎo)至牙槽骨。牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)是牙周膜中最主要的一種細(xì)胞，是牙周組織的再生以及形成新的附著的一種重要成分[1]。但是在牙周遭受創(chuàng)傷或者炎癥時(shí)，牙周膜的再生細(xì)胞數(shù)量的減少以及其生物學(xué)功能的減弱阻礙了該牙周組織完全再生的能力[2]。自噬(Autophagy)即Ⅱ型程序性死亡，是一種新的細(xì)胞程序性死亡方式，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要作用。在該過(guò)程中，細(xì)胞中多余的或功能障礙的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等經(jīng)過(guò)溶酶體進(jìn)行降解[3]。MicroRNAs(miRNA)是一種長(zhǎng)度約22 nt的內(nèi)源性表達(dá)的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控的過(guò)程中具有重要作用，能夠與靶基因互相作用而調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程[4]。miR-145是新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，包括miR-145-3p和miR-145-5p兩種結(jié)構(gòu)，可以調(diào)控多種細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程[5]。本研究探討miR-145-3p對(duì)HPDLFs細(xì)胞自噬過(guò)程的影響及其可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 HPDLFs的采集及培養(yǎng) 收集12～18歲因正畸需要減數(shù)而拔除的健康前磨牙，立即放入含有青-鏈霉素的預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)液中。取牙根1/3處的牙周膜組織，加入4 ml含0.5 g/L胰蛋白酶的DMEM培養(yǎng)液于37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化20 min。然后用不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗1次棄去上清，將組織塊置于35 mm的培養(yǎng)皿中，并加入含有200 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將組織塊上覆蓋一片無(wú)菌蓋玻片保證組織塊與蓋玻片之間的培養(yǎng)液充盈。37℃ CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，加1～2 ml培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換1次液。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底大約80%時(shí)，進(jìn)行首次傳代。按1∶3細(xì)胞計(jì)數(shù)傳代，取第5代HPDLFs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 材料與儀器

1.2.1 材料：DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miR-145-3p-mimic、miR-145-3p-inhibitor和miR-145-3p-NC由廣州銳博生物公司合成；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；青-鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白定量試劑盒、Western Blot發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；兔抗波形蛋白、鼠抗泛細(xì)胞角蛋白、兔抗Beclin-1、P62、LC3、HDAC4以及鼠抗GAPDH均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物。

1.2.2 儀器：雙人水平超凈工作臺(tái)(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)；二氧化碳細(xì)胞孵育箱(美國(guó)Thermo公司)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；DYC-p32型電泳儀(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)；轉(zhuǎn)膜儀(南京生興生物經(jīng)濟(jì)技術(shù)有限公司)；倒置熒光顯微鏡(DMIL LED Fluo；德國(guó)Leica公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus，BX63)、BIO-RADChemiDOC凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.3 HPDLFs的鑒定 將HPDLFs的第5代細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，消化的細(xì)胞以2×104個(gè)/ml接種在培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，待蓋玻片上長(zhǎng)滿單層細(xì)胞后取出備用。用無(wú)菌的PBS溶液洗去蓋玻片上的培養(yǎng)液，用0.4 g/L的多聚甲醛固定液固定20 min，然后用PBS溶液洗3次，吹干，免疫組織化學(xué)染色法鑒別波形絲蛋白(vimentin)和角蛋白(Keratin)，倒置熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取上述消化好的HPDLFs以2×104個(gè)/ml接種在6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-145-3p類似物(miR-145-3p-mimics)、miR-145-3p抑制物(miR-145-3p-inhibitor)和陰性對(duì)照(miR-145-3p normal control，miR-145-3p-NC)轉(zhuǎn)染至HPDLFs，轉(zhuǎn)染48 h。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書，在上述1.4轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞中進(jìn)行帶有GFP-LC3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，加樣后避光靜置15 min，然后加入到盛有400 μl新鮮無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液的6孔板中，轉(zhuǎn)染4 h后再加入完全培養(yǎng)基500 μl，24 h后觀察熒光。對(duì)10個(gè)不同視野的200個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Student’st-檢驗(yàn)分析顯著性差異。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.6 免疫熒光染色方法檢測(cè)細(xì)胞自噬 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用預(yù)冷多聚甲醛在4℃下固定30 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫處理10 min，PBS洗滌，室溫下封閉30 min，加入LC3一抗(1∶100)，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌細(xì)胞后，加入二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，熒光封片劑封片，顯微鏡下觀察LC3陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。每個(gè)切片任意選取5個(gè)視野。

1.7 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，RIPA裂解液提取總蛋白，將蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠的加樣孔進(jìn)行電泳，使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，TBST溫和洗滌3 min后加入相對(duì)應(yīng)的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌10 min×3次，加入二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次，加入配制好的ECL發(fā)光液，避光孵育5 min，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中采集圖片信息，圖片用Image pro plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 靶基因預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因分析 利用miRanda、TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-145-3p的潛在靶基因，其中HDAC4在miR-145-3p的3’-UTR上有結(jié)合位點(diǎn)。將第5代細(xì)胞以2×104個(gè)/ml接種于24孔板，用LipofectamineTM2000將熒光素酶報(bào)告載體(HDAC4-3’-UTR-WT或HDAC4-3’-UTR-Mut)與miR-145-3p-mimics/inhibitor/NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以Renilla熒光素酶質(zhì)粒(100 ng/孔)為對(duì)照，與載體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(Promega)檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 HPDLFs的鑒定 免疫組化染色結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白為陽(yáng)性染色，在胞質(zhì)內(nèi)陽(yáng)性顆粒均勻分布，胞漿染為棕黃色，胞核清晰并無(wú)染色；而來(lái)源于中胚層的角蛋白呈陰性染色，證明其為間質(zhì)細(xì)胞，且無(wú)混雜上皮來(lái)源細(xì)胞。見圖1。

波形蛋白陽(yáng)性染色 角蛋白陰性染色

2.2 MiR-145-3p過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)HPDLFs自噬 帶有GFP-LC3的質(zhì)粒在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功后，細(xì)胞中表達(dá)的自噬小體標(biāo)記物L(fēng)C3蛋白會(huì)發(fā)出綠色熒光。結(jié)果顯示，miR-145-3p-inhibitor組細(xì)胞內(nèi)有極其微弱的熒光，Blank和miR-145-3p-NC組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度強(qiáng)于miR-145-3p-inhibitor組(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-145-3p-mimics的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度最高，有大量自噬體形成。見圖2，表1。

圖2 MiR-145-3p誘導(dǎo)HPDLFs自噬

表1 GFP-LC3陽(yáng)性細(xì)胞百分比

2.3 4組轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)Beclin-1、P62和 LC3的蛋白表達(dá) P62蛋白在miR-145-3p-inhibitor組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)顯著高于其他3組(P<0.05)，而在Blank組、miR-145-3p-mimics組和miR-145-3p-NC組間蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-145-3p-mimics組細(xì)胞內(nèi)Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)顯著高于其他3組(P<0.05)，而在Blank組、miR-145-3p-NC組和miR-145-3p-inhibitor組間蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖3。

表2 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Beclin-1、P62和 LC3的蛋白表達(dá)

圖3 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Beclin-1、P62和 LC3的蛋白表達(dá)

2.4 MiR-145-3p靶基因預(yù)測(cè) 為確定MiR-145-3p在HPDLFs中發(fā)揮生物學(xué)功能的靶向作用點(diǎn)，我們使用TargetScan、miRanda等篩選MiR-145-3p潛在的下游靶向蛋白，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)MiR-145-3p與HDAC4在3’-UTR可能具有靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，HDAC4是MiR-145-3p的一個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)研究MiR-145-3p能否與去乙酰化酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)的3’-UTR位點(diǎn)結(jié)合，結(jié)果顯示，MiR-145-3p能夠與HDAC4基因3’-UTR結(jié)合，并抑制熒光素的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染突變載體的細(xì)胞內(nèi)沒有觀察到明顯的熒光素酶活性改變，表明HDAC4是MiR-145-3p的直接靶向蛋白。同時(shí)，我們用Western Blot檢測(cè)了4組轉(zhuǎn)染MiR-145-3p基因的細(xì)胞內(nèi)HDAC4蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-145-3p-mimics的細(xì)胞內(nèi)HDAC4的表達(dá)顯著低于其他3組(P<0.05)，而Blank組、轉(zhuǎn)染miR-145-3p-NC和miR-145-3p-inhibitor組細(xì)胞內(nèi)HDAC4的表達(dá)無(wú)顯著性差異。見表3、4，圖4、5。

表3 免疫熒光活性

表4 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HDAC4蛋白表達(dá)

圖4 生物信息軟件檢測(cè)HDAC4和MiR-145-3p潛在的結(jié)合位點(diǎn)

圖5 Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染MiR-145-3p基因的蛋白表達(dá)

3 討論

作為miRNA基因家族的成員之一，miR-145也是抑癌基因，在細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲、分化、增殖及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[6]。研究表明，人皮膚鱗癌的A431細(xì)胞中，miR-145通過(guò)靶向中性粒細(xì)胞胞漿因子2和IL-2調(diào)控JAK/STAT通路從而調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)凋亡[7]。再者，miR-145能夠靶向BNIP3(Bcl-2/E1B-19kDa 相互作用蛋3)以調(diào)控細(xì)胞的凋亡、線粒體功能異常、ROS等，最終調(diào)控線粒體的凋亡信號(hào)通路[8]。任明亮等[9]研究表明，miR-145-3p在多發(fā)性骨髓瘤中呈現(xiàn)出低表達(dá)的趨勢(shì)，可能是通過(guò)靶向激活P21以及抑制ULK1/LAMP2通路而促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的自噬、凋亡作用。但是miR-145-3p在人牙周膜成纖維細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究中，我們首先鑒定了提取的原代細(xì)胞，以保證HPDLFs細(xì)胞系無(wú)其他來(lái)源細(xì)胞，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-145-3p在HPDLFs細(xì)胞中可調(diào)控自噬，這種作用可能是通過(guò)靶向抑制HDAC4表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

自噬是在真核生物中廣泛存在的維持自身穩(wěn)定的機(jī)制，通過(guò)和溶酶體的互相作用，在自噬有關(guān)基因和信號(hào)分子參與下，進(jìn)行降解自身過(guò)多或受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等從而為細(xì)胞的生物合成提供原料和能量，對(duì)細(xì)胞分化、發(fā)育以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定提供重要的保障[10]。Wu等[11]曾證實(shí)miR-145-3p能夠通過(guò)靶向HDAC4抑制增殖并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和自噬，但對(duì)HPDLFs細(xì)胞的自噬是否有調(diào)控作用尚未可知。LC3(Microtubule-associated protein light chain 3)蛋白位于自噬小體細(xì)胞質(zhì)表面，是自噬小體形成的標(biāo)志，也是自噬研究中常用的標(biāo)志物[12]。本研究中體外實(shí)驗(yàn)，miR-145-3p-inhibitor、miR-145-3p-NC、miR-145-3p-mimics分別和帶有GFP-LC3的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145-3p-mimics組細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度最高，而抑制miR-145-3p表達(dá)后，幾乎無(wú)熒光產(chǎn)生，這提示在促進(jìn)miR-145-3p表達(dá)的HPDLFs細(xì)胞中，LC3大量分泌，表明有大量的自噬小體形成，自噬活性升高，維持了HPDLFs細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。這與Wu等[11]關(guān)于miR-145-3p能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬的研究結(jié)果基本一致。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)表明，在抑制miR-145-3p表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)，自噬溶酶體數(shù)量很少，LC3蛋白表達(dá)很弱，而促進(jìn)miR-145-3p表達(dá)后，自噬溶酶體大量生成，LC3蛋白表達(dá)顯著增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，miR-145-3p可能是通過(guò)提高人牙周膜成纖維細(xì)胞的自噬活性，為牙周組織再生能力提供原料和能量等保障。

為進(jìn)一步探討miR-145-3p促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞的自噬活性的可能的作用機(jī)制，我們檢測(cè)其他組蛋白HDAC4是否存在靶向關(guān)系。HDAC4是一種無(wú)DNA結(jié)合活性的組蛋白去乙?；福饕峭ㄟ^(guò)和其他的蛋白質(zhì)結(jié)合成有調(diào)解活性的抑制轉(zhuǎn)錄的復(fù)合物，并且還能夠使組蛋白去乙?；谷旧w凝聚最終抑制轉(zhuǎn)錄[13]。Shao等[14]研究表明，miR-138通過(guò)HDAC4/PGRN或HDAC4/NF-kB調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中相關(guān)的炎性細(xì)胞因子，并揭示了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可能通過(guò)靶向該機(jī)制來(lái)加速治療策略的發(fā)展。Park等[15]報(bào)道在人類乳腺癌TAMR/MCF-7細(xì)胞中用HDAC抑制劑MHY218處理后自噬標(biāo)記物beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯增加。本研究中我們通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，HDAC4是MiR-145-3p的直接靶向蛋白，并且二者之間具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，在miR-145-3p基因高度表達(dá)的細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1顯著升高，而抑制miR-145-3p表達(dá)后，Beclin-1表達(dá)明顯下降；而P62蛋白在該2組細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。提示miR-145-3p在人牙周膜成纖維細(xì)胞中促進(jìn)自噬的作用可能是通過(guò)靶向抑制HDAC4的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-145-3p在人牙周膜成纖維細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)自噬的作用，可能是通過(guò)抑制靶向基因HDAC4，從而促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3表達(dá)并減少P62的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。