胡仲輝 吳文博 趙慶濤 牛占叢 張霄鵬 張華 王會恩 袁征 段國辰

肺癌在我國惡性腫瘤中發(fā)病率與死亡率居第一位[1]，其防治措施是當(dāng)前研究的熱點。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是一種在缺氧條件下廣泛存在于人和動物細胞內(nèi)的細胞因子，對腫瘤生長、血管形成、轉(zhuǎn)移、凋亡及耐藥起重要作用。HIF-1由1個α和1個β亞單位組成，其中HIF-1α表達受細胞內(nèi)氧濃度的高度調(diào)控，其存在一個氧依賴降解區(qū)(ODD)[2]，能感受外界氧濃度的變化；而HIF-1β不受氧濃度的影響。在腫瘤缺氧的微環(huán)境中，腫瘤細胞通過HIF-1α的高表達來維持其氧和代謝的穩(wěn)定，促進自身的生長和轉(zhuǎn)移。本實驗通過人肺腺癌A549與人小細胞肺癌H446細胞株體外實驗，研究HIF-1α對小細胞肺癌及非小細胞肺癌細胞凋亡、增殖的影響，以及HIF-1α表達與肺癌細胞Livin、Caspase-3表達的關(guān)系，探討肺癌的發(fā)展機制，為肺癌治療新靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系：H446人小細胞肺癌與A549人肺腺癌細胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑：1640培養(yǎng)基(Hyclone,SH30809.01)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone,SH30526.01)；胎牛血清(四季青,11011-8611)；胰酶(Solarbio,T8150)；基質(zhì)膠(CORNING，356234)；lipofectamine2000(invitrogen,11668-019)；PI-AnnexinV(MULTI SCIENCES，A91231)；lipofectamine2000(invitrogen,11668-019)；RIPA裂解液(北京索來寶公司，R0020)；一抗(博奧森公司)：Caspase3：bs-0081R，Livin：bs-0738R；二抗(中杉金橋公司，ZB2301)；ECL發(fā)光試劑盒(中杉金橋公司，sc-2048)。

1.1.3 主要儀器:二氧化碳培養(yǎng)箱(Panasonic,MCO-18AC)；酶標(biāo)儀(Thermo，MuLTiSKAN MK3)；6孔板(KIRGEN)；24孔板(NEST)；倒置顯微鏡(OLYMPUS,IX71)；T25細胞培養(yǎng)瓶(CORNING，430639)；流式細胞儀(BECKMAN COULTER)；Transwell小室(Costar，24219051)；超低溫冰箱(SANYO,MDF-U72V)；0.22 μm一次性濾器(MILLEX,SLGP033RB)；低速離心機(時代北利，LDZ5-2)；恒溫水浴箱(春蘭美標(biāo)，HH-US-B)；蛋白濃度定量儀(Eppendorf，22331 hamburg)；電泳儀(北京六一公司，DYCZ-24DN)；TS-8型超凈工作臺(滬凈，SW-CJ-1FD)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：細胞株H446培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱。1640培養(yǎng)液中加10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素。培養(yǎng)液隔日換液。當(dāng)培養(yǎng)細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%，先用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗2次，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化收獲細胞。肺癌A549細胞用含10%FBS的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。若培養(yǎng)基顏色發(fā)黃或變淺時，進行換液。當(dāng)細胞密度達80%～90%時，進行傳代。

1.2.2 過表達載體構(gòu)建及SiRNA設(shè)計合成：構(gòu)建HIF-1α的pEX2的表達載體，設(shè)計合成SiRNA干擾序列和無關(guān)序列(吉瑪基因)。序列如下：SiRNA1217:5’-3’GCCGCUCAAUUUAUGAAUATT,UAUUCAUAAAUUGAGCGGCTT；SiRNA2258:5’-3’CCACCACUGAUGAAUUAAATT,UUUAAUUCAUCAGUGGUGGTT；SiRNA1612:5’-3’GCUGGAGACACAAUCAUAUTT,AUAUGAUUGUGUCUCCAGCTT；NC:5’-3’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT,ACGUGACACGUUCGGAGAATT。

1.2.3 干擾序列篩選：分別取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化后1 000 r/min、5 min離心，接種于6孔板中，待細胞生長至80%，同時轉(zhuǎn)染SiRNA1217、SiRNA2258、SiRNA1612、NC，24 h后去掉各組的培養(yǎng)液，加0.9%氯化鈉溶液洗一遍，加trizol提取RNA，Real-Time PCR檢測HIF-1αmRNA表達，篩選出干擾效率最高的是SiRNA2258。

1.2.4 凋亡檢測：對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化后1 000 r/min、5 min離心，接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至80%，細胞分為3組：過表達組轉(zhuǎn)染HIF-1α表達載體、干擾組轉(zhuǎn)染SiRNA2258，同時設(shè)對照組，37℃、飽和濕度、含體積分數(shù)為0.05的CO2孵育箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)液孵育24 h后，去掉各組的培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化后1 000 r/min、5 min離心，加0.9%氯化鈉溶液洗一遍，加PI和ANNEXIN V染液處理，流式細胞儀檢測凋亡。

1.2.5 遷移及侵襲：對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化后1 000 r/min、5 min離心，接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至80%，細胞分為3組：過表達組轉(zhuǎn)染HIF-1α表達載體、干擾組轉(zhuǎn)染SiRNA2258，同時設(shè)對照組，將轉(zhuǎn)染后細胞接種于Transwell小室上室中，并在下室中加入含20%血清的培養(yǎng)基。24 h后取出小室，用棉簽擦去室內(nèi)面細胞。甲醇固定3 min。姬姆薩染液室溫孵育30 min。顯微鏡觀察細胞遷移并拍照，隨機選取5個視野，計數(shù)。先在Transwell鋪一層基質(zhì)膠，待基質(zhì)膠凝固，將轉(zhuǎn)染后細胞接種于Transwell小室上室中，并在下室中加入含20%血清的培養(yǎng)基。24 h后取出小室，用棉簽擦去室內(nèi)面細胞。甲醇固定3 min。姬姆薩染液室溫孵育30 min。顯微鏡觀察細胞侵襲并拍照，隨機選取5個視野，計數(shù)。

1.2.6 Real-Time PCR檢測GLUT-1、Livin和Caspase-3 mRNA表達：分別取H446及A549對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化后1 000 r/min、5 min離心，接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至80%，細胞分為3組：過表達組轉(zhuǎn)染HIF-1α表達載體、干擾組轉(zhuǎn)染SiRNA2258，同時設(shè)對照組，37℃、飽和濕度、含體積分數(shù)為0.05的CO2孵育箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)液孵育24 h后，去掉各組的培養(yǎng)液，加0.9%氯化鈉溶液洗一遍，加trizol提取RNA，Real-Time PCR檢測HIF-1α、GLUT-1 mRNA表達。根據(jù)Real-Time PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計算公式，計算出相對定量結(jié)果。計算公式為：△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因,△△CT=△CT目的基因-對照組目的基因△CT平均值。

1.2.7 Wesren Blot檢測GLUT-1、Livin和Caspase-3蛋白表達：分別取H446及A549對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化后1 000 r/min、5 min離心，接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至80%，細胞分為3組：過表達組轉(zhuǎn)染HIF-1α表達載體，干擾組轉(zhuǎn)染SiRNA2258，同時設(shè)對照組，37℃、飽和濕度、含體積分數(shù)為0.05的CO2孵育箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)液孵育48 h后，去掉各組的培養(yǎng)液，加0.9%氯化鈉溶液洗一遍，加蛋白裂解液裂解細胞提取總蛋白，Wesren Blot檢測GLUT-1、Livin和Caspase-3蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α表達對A549細胞凋亡及遷移、侵襲能力的影響

2.1.1 凋亡：流式細胞儀結(jié)果顯示，過表達組(98.73±0.25)%與對照組(97.27±0.25)%比較，凋亡細胞顯著減少(P<0.01)；干擾組(86.53±4.54)%與對照組比較，凋亡細胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但其晚期凋亡細胞數(shù)(4.63±0.84)%較對照組(1.67±0.12)%明顯增多(P<0.05)。見圖1。

圖1 A549 3組細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果

2.1.2 遷移及侵襲：過表達組與對照組比較，遷移細胞數(shù)明顯增多(P<0.05)，侵襲細胞顯著增多(P<0.01)；干擾組與對照組比較，遷移及侵襲細胞數(shù)均顯著減少(P<0.01)。見表1。

表1 A549細胞遷移及侵襲

2.2 HIF-1α表達對H446細胞凋亡及遷移、侵襲能力的影響

2.2.1 凋亡：過表達組(98.33±0.21)%與對照組(98.07±0.45)%比較，正常細胞與凋亡細胞數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干擾組(75.60±1.13)%與對照組比較，正常細胞數(shù)顯著減少(P<0.01)。見圖2。

圖2 H446 3組細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果

2.2.2 遷移及侵襲：干擾組與對照組比較，遷移及侵襲細胞數(shù)均顯著減少(P<0.01)；過表達組與對照組比較，遷移細胞數(shù)明顯增多(P<0.05)，侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 H446細胞遷移及侵襲

2.3 A549細胞HIF-1α表達對GLUT-1、Livin、Csapase-3表達的影響

2.3.1 Real-time PCR：過表達組與對照組比較，GLUT-1 mRNA表達明顯增多(P<0.05)，Livin mRNA表達顯著增多(P<0.01)，Caspase-3 mRNA表達顯著減少(P<0.01)；干擾組與對照組比較，GLUT-1 mRNA表達顯著減少(P<0.01)，Livin mRNA表達顯著減少(P<0.01)，Caspase-3 mRNA表達顯著增多(P<0.01)。見表3，圖3。

表3 A549細胞3組HIF-1α、GLUT-1 mRNA的相對定量結(jié)果

A B

2.3.2 Wesren Blot：干擾組相較于對照組，GLUT-1蛋白表達明顯減少(P<0.05)，Livin蛋白表達明顯減少(P<0.05)，Caspase-3蛋白表達顯著增加(P<0.01)；過表達組與對照組比較，GLUT-1蛋白表達顯著增多(P<0.01)，Livin蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，Caspase-3蛋白表達明顯減少(P<0.05)。見表4，圖4。

圖4 A549細胞3組GLUT-1、Livin、Caspase-3蛋白表達情況

表4 A549 3組GLUT-1、Livin、Caspase-3蛋白的相對表達

2.4 H446細胞HIF-1α表達對GLUT-1、Livin、Csapase-3表達的影響

2.4.1 Real-time PCR：過表達組與對照組比較，GLUT-1 mRNA表達顯著增多(P<0.01)，Livin mRNA表達顯著增多(P<0.01)，Caspase-3 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干擾組較對照組，GLUT-1mRNA表達顯著減少(P<0.01)，Livin mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，Caspase-3 mRNA表達顯著增多(P<0.01)。見表5，圖5。

表5 H446細胞3組GLUT-1、Livin、Caspase-3 mRNA的相對定量

A B

2.4.2 Wesren Blot：干擾組與對照組比較，GLUT-1蛋白表達顯著減少(P<0.01)，Livin蛋白表達顯著減少(P<0.01)，Caspase-3蛋白表達顯著增多(P<0.01)；過表達組相較于對照組，GLUT-1蛋白表達明顯增多(P<0.05)，Livin蛋白表達顯著增多(P<0.01)，Caspase-3蛋白表達明顯減少(P<0.05)。見表6，圖6。

表6 H446 3組GLUT-1、Livin、Caspase-3蛋白的相對表達

圖6 H446細胞3組GLUT-1、Livin、Caspase-3蛋白表達情況

3 討論

乏氧是實質(zhì)性腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，研究表明，乏氧是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的始動因素，可促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細胞對放化療耐受[3]。HIF-1是一種在乏氧條件下廣泛存在于人和動物細胞內(nèi)的細胞因子，在許多腫瘤中大量表達，其活性在維持腫瘤細胞的能量代謝、新生血管形成以及促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中起重要作用。Volm等[4]研究表明，HIF-1α是小細胞肺癌生長的積極因素。本研究中，干擾HIF-1α表達后，A549及H446細胞凋亡均明顯增加、遷移及侵襲明顯減少，證實HIF-1α可以作為小細胞和非小細胞肺癌治療的靶點。對于H446細胞，HIF-1α過表達組與對照組間細胞凋亡與侵襲無明顯差異，提示HIF-1α抑制非小細胞肺癌凋亡、促進其侵襲的機制可能涉及多種因素協(xié)同作用。

研究表明，HIF-1α可結(jié)合不同缺氧反應(yīng)基因(hypoxia response gene,HRG)啟動子和增強子上的HF-1結(jié)合位點[5]，HIF-1α可激活或誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，促進腫瘤新生血管生成，維持腫瘤細胞生長的能量代謝，為腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

GLUTs是由14種亞型組成的、分布在細胞膜上的跨膜糖蛋白，其中GLUT-1研究最廣泛。GLUT-1存在于幾乎所有的組織中[6]。在缺氧微環(huán)境中，惡性腫瘤細胞表面往往異常高表達GLUT1以增加葡萄糖的攝取滿足其能量需求，從而耐受缺氧。GLUT-1被發(fā)現(xiàn)與過表達與乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌的進展呈正相關(guān)[7]。Zhao等[8]報道GLUT-1對小細胞肺癌進展與預(yù)后的重要影響。由于GLUT-1與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后息息相關(guān)，降低GLUT-1表達的治療成為臨床治療惡性腫瘤的一個重要靶點。本研究中，干擾A549細胞以及H446細胞的HIF-1α表達可以在mRNA和蛋白水平明顯降低GLUT-1表達；A549 和H446細胞的HIF-1α過表達可以在mRNA和蛋白水平增加GLUT-1表達。說明HIF-1α與 GLUT-1在非小細胞肺癌及小細胞肺癌中的表達均呈正相關(guān)，可以通過抑制HIF-1α表達以下調(diào)GLUT-1表達，減少癌細胞能量供應(yīng)，從而達到抑制腫瘤增殖、進展的作用。

Livin有兩種mRNA亞型,即Livinα和Livinβ，已被發(fā)現(xiàn)在多數(shù)腫瘤中高表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，對腫瘤細胞的凋亡有抑制作用[9]。研究表明，Livin主要通過抑制Caspase活性，尤其是抑制Caspase-3蛋白活性以阻斷凋亡途徑而起到抑制凋亡的作用[9,10]。李國權(quán)[11]研究表明HIF-1α與Survivin在非小細胞肺癌中表達呈正相關(guān)，而對于是否存在HIF-1α與Livin的相關(guān)性卻少見報道。本研究中，干擾A549細胞HIF-1α表達可以在mRNA和蛋白水平明顯降低Livin表達；A549 HIF-1α過表達可以增加Livin mRNA表達，而Livin蛋白表達未見增加，說明可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制。H446細胞HIF-1α過表達能明顯增加Livin mRNA和蛋白的表達；干擾H446細胞HIF-1α表達可以在蛋白水平減少Livin表達，而在mRNA水平不能明顯降低其表達，說明轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)可能是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果。以上結(jié)果說明HIF-1α與 Livin在肺癌細胞中的表達呈正相關(guān)，可以通過抑制HIF-1α表達以下調(diào)Livin表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，成為肺癌治療的一個靶點。

研究認為，Caspase-3是Caspase家族中的關(guān)鍵酶，是最重要也是最終的效應(yīng)型家族成員，在細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用[12,13]，Caspase-3蛋白在被上游信號激活后產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng),進而引發(fā)細胞凋亡。肖麗娜等[14]對234例非小細胞肺癌患者的研究中指出，肺小細胞肺癌Caspase-3表達與細胞凋亡呈正相關(guān)。本研究中，干擾A549及H446細胞HIF-1α表達后，Caspase-3表達在mRNA及蛋白水平均明顯增加；A549細胞HIF-1α過表達后Caspase-3表達明顯減少。該結(jié)果與細胞凋亡結(jié)果一致，證明肺癌細胞中HIF-1α與 Caspase-3的表達呈負相關(guān)，通過抑制HIF-1α表達以上調(diào)Caspase-3表達，可以作為肺癌治療的新靶點，達到誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的目的。對于H446細胞，HIF-1α過表達后Caspase-3蛋白表達明顯減少，mRNA表達較對照組則無統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)合細胞凋亡結(jié)果，說明小細胞肺癌中HIF-1α對Caspase-3的轉(zhuǎn)錄激活可能存在多種因素協(xié)同作用。

綜上所述，在非小細胞肺癌和小細胞肺癌中，抑制HIF-1α表達可以有效增加肺癌細胞凋亡、抑制肺癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移。同時，肺癌細胞中HIF-1α與 GLUT1及Livin的表達呈正相關(guān)，Caspase-3與HIF-1α、Livin的表達呈負相關(guān)，提示抑制HIF-1α治療肺癌的機制可能是通過下調(diào)GLUT1、Livin的表達以及上調(diào)Caspase-3表達以達到促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移的目的。