肖 昊 趙 一 王 麗 譚碧娥

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省動(dòng)物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410125)

腸道是仔豬生長發(fā)育的核心和快速生長的基礎(chǔ)，氨基酸作為腸道優(yōu)先利用的重要營養(yǎng)物質(zhì)，對腸道生長發(fā)育發(fā)揮起著重要的作用，其中精氨酸(Arg)在調(diào)節(jié)動(dòng)物營養(yǎng)代謝和生長發(fā)育等多種生理功能中發(fā)揮著重要作用[1]。Arg能刺激蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖、DNA合成、細(xì)胞保護(hù)作用和遷移等細(xì)胞合成代謝途徑[2-5]。本課題組前期研究表明應(yīng)激因素通過下調(diào)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路相關(guān)蛋白的水平及活性，破壞斷奶仔豬腸道形態(tài)和功能，飼糧中加入適量的Arg可通過激活mTOR信號通路緩解仔豬腸道損傷，改善腸上皮細(xì)胞增殖和胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成[6]；Arg增加了脂多糖(LPS)處理下豬腸上皮細(xì)胞中涉及mTOR信號通路的蛋白質(zhì)的合成[5]。溶酶體氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體溶質(zhì)載體家族蛋白38成員A9(SLC38A9)和CASTOR1是mTOR復(fù)合物1(mTORC1)信號通路的Arg傳感器[7]。研究發(fā)現(xiàn)，通過雷帕霉素(Rap)抑制mTOR后Arg在細(xì)胞內(nèi)的濃度較細(xì)胞外升高了42.2%[8]。然而，目前對于mTORC1失調(diào)所引發(fā)的信號通路及對Arg攝取與代謝了解甚少。

y+(高親和力、非Na+依賴轉(zhuǎn)運(yùn)體)和Na+依賴轉(zhuǎn)運(yùn)體(如b0,+、B0,+和y+L)系統(tǒng)是Arg轉(zhuǎn)運(yùn)的2個(gè)主要的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。腸上皮細(xì)胞中70%的L-Arg都是通過y+系統(tǒng)運(yùn)輸。本課題組前期研究表明，L-硝基精氨酸甲酯可通過抑制一氧化氮(NO)通路增加Arg攝取以及陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(CAT2)和L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(LAT1)的蛋白表達(dá)[9]。然而，Arg的降解和轉(zhuǎn)運(yùn)對調(diào)節(jié)Arg通量的作用尚未明晰。本研究利用Rap抑制mTOR信號通路，基于mTOR信號通路探討其在豬腸上皮細(xì)胞Arg攝取中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)以及Arg缺失的DMEM-H培養(yǎng)基配制、細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)、Western blotting等試驗(yàn)所需試劑與耗材的來源均同前期相關(guān)研究[10]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含不同濃度Arg(100、350 μmol/L)和Rap(0、10 nmol/L)的DMEM-H培養(yǎng)基培養(yǎng)IPEC-J2細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)方法參照前期相關(guān)研究[10]，培養(yǎng)3 d后，收集細(xì)胞用于細(xì)胞周期、RNA提取、蛋白檢測。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測

1.2.2.1 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測吸光度(OD)值

將IPEC-J2細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，以含不同濃度Rap(0、5、10、25、50、100 nmol/L)的DMEM-H培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，參照MTT試劑盒說明書檢測OD值。

1.2.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)

將IPEC-J2細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，以含不同濃度Rap(0、5、10、25、50、100 nmol/L)的DMEM-H培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后1 000 r/min離心，去除上清液，重懸細(xì)胞后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)量細(xì)胞數(shù)量。

1.2.2.3 5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(EdU)檢測

EdU檢測試劑盒購于瑞博生物技術(shù)有限公司，檢測步驟按照說明書進(jìn)行，簡要的過程主要包括EdU標(biāo)記、細(xì)胞固定化、Apollo染色、DNA染色及圖像攝取及分析。除了試劑盒中具備的，所用甘氨酸、多聚甲醛等試劑均為國產(chǎn)分析純。采用熒光顯微鏡觀察，在不同波長下獲取圖像，得到的紅色細(xì)胞為增殖細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞為所有細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率(%)=(增殖細(xì)胞數(shù)目/所有細(xì)胞數(shù)目)×100。

1.2.2.4 細(xì)胞周期檢測

采用凱基細(xì)胞周期檢測試劑盒(KGA521)檢測Arg或Rap處理后細(xì)胞周期變化，檢測步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。使用胰蛋白酶收集細(xì)胞后，輕輕吹打，混勻，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞用75%乙醇4 ℃固定過夜后，試驗(yàn)當(dāng)天4 000 r/min離心2 min，去除上清液，每1×106個(gè)細(xì)胞加入0.5 mL碘化丙啶染液(500 μL染色緩沖液、25 μL 20×碘化丙啶染色液、10 μL 50×RNaseA)。重懸細(xì)胞，37 ℃避光溫浴30 min，4 ℃或冰浴避光保存，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.2.3 RT-qPCR檢測

RNA提取、測定，cDNA的獲得以及RT-qPCR的操作方法等參照前期相關(guān)研究[11]。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。本試驗(yàn)中所有引物均由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 Arg轉(zhuǎn)運(yùn)載體的引物序列

1.2.4 Western blotting檢測

按照Tan等[5]的方法進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測。包括蛋白激酶Cα(PKCα)、陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(CAT1)、CAT2和β-actin在內(nèi)的所有一抗購置于Santa Cruz Biotechnology公司。精氨酸酶Ⅰ、精氨酸酶Ⅱ、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk)、磷酸化Erk(p-Erk)、cFos和磷酸化cFos(p-cFos)購置于美國Cell Signaling Technology公司。所有的目的蛋白的表達(dá)量均與β-actin進(jìn)行對比。

1.2.5 細(xì)胞Arg攝取檢測

處理細(xì)胞后，移去培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗細(xì)胞3次(37 ℃)。隨后每孔加1 mL含[3H]Arg的轉(zhuǎn)移緩沖液(2 μCi/mL，5 μmol/L)，搖床輕輕搖動(dòng)5 min。棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液快速洗滌細(xì)胞3次。吹干細(xì)胞，每孔加500 μL 1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)，37 ℃溶解細(xì)胞，然后加入250 μL乙酸，混勻。測定蛋白質(zhì)的含量用50 μL細(xì)胞溶液。另取500 μL細(xì)胞溶液于18 mL閃爍計(jì)數(shù)瓶中，加15 mL閃爍液。25 ℃靜置過夜后測定[3H]Arg的每分鐘衰變數(shù)(DPM)。Arg的攝取率結(jié)果以nmol/(min·mg prot)表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019初步整理后，用SPSS 19.0軟件對樣本進(jìn)行單因素方差分析和Turkey檢驗(yàn)，使用Graph Prime 7生成數(shù)據(jù)圖。數(shù)據(jù)均是以100 μmol/L Arg組(對照組)作為參照的相對表達(dá)量表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rap抑制豬腸上皮細(xì)胞增殖

如圖1-A可見，隨著培養(yǎng)基中Rap的濃度從0 nmol/L升至100 nmol/L，OD值也隨之逐漸下降，并從10 nmol/L開始出現(xiàn)極顯著降低(P<0.01)。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，細(xì)胞數(shù)量隨著Rap濃度的增加而降低，其中在10 nmol/L時(shí)細(xì)胞數(shù)量減少1/2(圖1-B)。因此，選取10 nmol/L作為隨后試驗(yàn)中抑制mTOR信號通路的Rap工作濃度。培養(yǎng)基中Arg濃度為100 μmol/L時(shí)，添加10 nmol/L Rap后mTOR(P<0.01)和磷酸化mTOR(p-mTOR)(P<0.01)的蛋白表達(dá)量及其下游的真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)(P>0.05)和磷酸化4EBP1(p-4EBP1)(P<0.01)的蛋白表達(dá)量均有不同程度的降低，表明10 nmol/L Rap抑制了mTOR信號通路(圖2)。在添加10 nmol/L Rap條件下，將培養(yǎng)基中Arg濃度由100 μmol/L提高到350 μmol/L，極顯著提高了4EBP1、p-4EBP1和磷酸化p70核糖體S6激酶(p-P70S6K)的蛋白表達(dá)量(P<0.01)。EdU檢測結(jié)果(圖3)表明，培養(yǎng)基中Arg濃度為100 μmol/L時(shí)，添加Rap極顯著降低了細(xì)胞的增殖率(P<0.01)，而在Arg濃度為350 μmol/L的培養(yǎng)基中添加Rap對細(xì)胞的增殖率沒有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“**”表示與0 nmol/L相比差異極顯著(P<0.01)。Value columns with “**” mean extremely significant difference compared with 0 nmol/L (P<0.01).

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；4EBP1：真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1 eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1；p-4EBP1：磷酸化真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1 phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1；p-P70S6K：磷酸化p70核糖體S6激酶 phosphorylated p70 ribosomal protein S6 kinase；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin；p-mTOR：磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 phosphorylated mammalian target of rapamycin；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白。

A：熒光顯微鏡觀察圖 fluorescence microscope observation map；B：增殖率 proliferation rate。Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 4′,6-diamidino-2-phenylindole；EdU：5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷 5-ethynyl-2′-deoxyuridine；Merge：融合。

2.2 Rap抑制細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)

細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中Arg濃度為100或350 μmol/L時(shí)，添加Rap后細(xì)胞大部分停留在G1期，相對于100 μmol/L Arg組，100 μmol/L Arg+Rap組和350 μmol/L Arg+Rap組的G2期和S期細(xì)胞數(shù)量均極顯著降低(P<0.01)，凋亡細(xì)胞數(shù)量也隨之極顯著降低(P<0.01)(圖4)。結(jié)合2.1中結(jié)果，表明Rap抑制了mTOR信號通路的活性，從而抑制豬腸上皮細(xì)胞增殖，提高Arg濃度能顯著改善Rap對細(xì)胞增殖的抑制作用。

A：流式細(xì)胞直方圖 flow cell histogram；B：細(xì)胞周期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 cell cycle data statistical results。 Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；Channels：通道；Apoptosis:細(xì)胞凋亡；Dip：二倍體 diploid；G1：G1期 G1-phase；G2：G2期 G2-phase；S：S期 S-phase。

2.3 Rap通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)-蛋白激酶(Akt)-B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl2)信號通路抑制細(xì)胞凋亡

圖4顯示，Rap抑制IPEC-J2細(xì)胞凋亡。通過Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Arg濃度為100或350 μmol/L的培養(yǎng)基中添加Rap均極顯著促進(jìn)了B細(xì)胞淋巴瘤-xL(Bcl-xL)的蛋白表達(dá)量，極顯著降低了細(xì)胞色素C(Cyt-C)的蛋白表達(dá)量(P<0.01)。而僅在Arg濃度為100 μmol/L的培養(yǎng)基中添加Rap能夠極顯著降低半胱氨酸蛋白酶3(Caspase 3)和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase 3)(17 ku)的蛋白表達(dá)量(P<0.01)；將培養(yǎng)基中Arg濃度由100 μmol/L提高到350 μmol/L后，添加Rap極顯著降低了Bcl2相關(guān)x蛋白(Bax)的蛋白表達(dá)量(P<0.01)，極顯著提高了Caspase 3和Cleaved Caspase 3(19 ku)的蛋白表達(dá)量(P<0.01)(圖5)。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；Cyt-C：細(xì)胞色素C cytochrome C；Bax：Bcl2相關(guān)x蛋白 Bcl2 associated X protein；Bcl-xL：B細(xì)胞淋巴瘤-xL B-cell lymphoma-extra large；Caspase 3：半胱氨酸蛋白酶3 cysteine aspartic acid specific protease 3；Cleaved Caspase 3：活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 cleaved cysteine aspartic acid specific protease 3。

圖6顯示，培養(yǎng)基中Arg濃度為100 μmol/L時(shí)，添加Rap后p-PI3K和p-Akt的蛋白表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)，而Akt的蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。將培養(yǎng)基中Arg濃度由100 μmol/L提高到350 μmol/L后，添加Rap極顯著提高了p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表達(dá)量(P<0.01)。因此，Rap抑制豬腸上皮細(xì)胞凋亡可能是通過激活PI3K-Akt-Bcl2信號通路實(shí)現(xiàn)的。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；Akt：蛋白激酶 protein kinase；p-Akt：磷酸化蛋白激酶 phosphorylated protein kinase；PI3K：磷脂酰肌醇-3-羥激酶 phosphatidylinositol-3-hydroxykinase；p-PI3K：磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶 phosphorylated phosphatidylinositol-3-hydroxykinase；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白。

2.4 PKCα-Erk/cFos-CAT2信號通路可能是Rap調(diào)控Arg轉(zhuǎn)運(yùn)載體促進(jìn)Arg攝取的關(guān)鍵通路

為進(jìn)一步探討mTOR信號通路在細(xì)胞Arg攝取過程中的作用，利用同位素示蹤法檢測了Rap處理下不同培養(yǎng)基處理的細(xì)胞中Arg的攝取率。圖7顯示，提高培養(yǎng)基中Arg濃度，IPEC-J2細(xì)胞的Arg攝取率極顯著上升(P<0.01)。而在不同濃度Arg培養(yǎng)基中添加Rap后，IPEC-J2細(xì)胞的Arg攝取率均極顯著上升(P<0.01)，表明Arg濃度對其沒有影響。為進(jìn)一步探討Rap通過何種機(jī)制促進(jìn)Arg的轉(zhuǎn)運(yùn)，本試驗(yàn)檢測了Arg轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA和蛋白表達(dá)量。圖8顯示，在Arg濃度為100或350 μmol/L的培養(yǎng)基中添加Rap極顯著提高了CAT2的mRNA表達(dá)量(P<0.01)，且極顯著降低了LAT1的mRNA表達(dá)量(P<0.01)，而在Arg濃度為350 μmol/L的培養(yǎng)基中添加Rap則極顯著降低了CAT1的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。將培養(yǎng)基中Arg濃度由100 μmol/L提高到350 μmol/L，CAT1、CAT2和LAT1的mRNA表達(dá)量沒有顯著變化(P>0.05)。圖9顯示，在Arg濃度為100或350 μmol/L的培養(yǎng)基中添加Rap均極顯著降低了CAT1和質(zhì)子偶聯(lián)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(PAT1)的蛋白表達(dá)量(P<0.01)，極顯著增加了鈉離子依賴的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SNAT2)的蛋白表達(dá)量(P<0.01)。而在100 μmol/L Arg培養(yǎng)基中添加Rap和350 μmol/L Arg培養(yǎng)下則極顯著提高了CAT2的蛋白表達(dá)量(P<0.01)。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；CAT1：陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1 cationic amino acid transporter 1；CAT2：陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2 cationic amino acid transporter 2； LAT1：L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1 L-type amino acid transporter 1 。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；CAT1：陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1 cationic amino acid transporter 1；CAT2：陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2 cationic amino acid transporter 2；PAT1：質(zhì)子偶聯(lián)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 proton-coupled amino acid transporter 1；SNAT2： 鈉離子依賴的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 2 sodium-coupled neutral amino acid transporter 2；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白。

上述結(jié)果表明，CAT2無論是在蛋白水平還是在mRNA水平的表達(dá)量，在100 μmol/L Arg +Rap處理下都是上調(diào)的，因此猜測CAT2是Rap調(diào)控Arg攝取率上升的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)載體。72 h培養(yǎng)后結(jié)果(圖10)表明，100 μmol/L+Rap處理極顯著提高了PKCα、p-Erk、p-cFos、cFos和CAT2的蛋白表達(dá)量(P<0.01)，極顯著降低了Rictor的蛋白表達(dá)量(P<0.01)；而350 μmol/L Arg+Rap處理則極顯著降低了PKCα和Rictor的蛋白表達(dá)量(P<0.01)，極顯著提高了p-Erk的蛋白表達(dá)量(P<0.01)。結(jié)果提示，Rap抑制mTOR信號通路后可能通過PKCα-Erk/cFos-CAT2信號通路調(diào)控Arg轉(zhuǎn)運(yùn)載體促進(jìn)Arg的攝取。

Arg：精氨酸 arginine；Rap：雷帕霉素 rapamycin；PKCα：蛋白激酶Cα protein kinase Cα；Erk：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 extracellular signal-regulated kinase；p-Erk：磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 phosphorylated extracellular signal-regulated kinase；CAT2：陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2 cationic amino acid transporter 2。

3 討 論

氨基酸在動(dòng)物腸道應(yīng)激損傷的修復(fù)中起著關(guān)鍵作用。本課題組在研究嘔吐毒素對腸道黏膜的應(yīng)激損傷中發(fā)現(xiàn)，嘔吐毒素能顯著降低空腸和回腸黏膜中的p-Akt和p-mTOR的蛋白表達(dá)量，同時(shí)降低空腸黏膜中p-4EBP1的蛋白表達(dá)量[6]。飼糧中添加氨基酸如谷氨酸能顯著降低嘔吐毒素對Akt/mTOR/4EBP1信號通路的抑制作用[11]。mTOR是細(xì)胞生長和增殖的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，通過磷酸化作用調(diào)控mRNA的翻譯來調(diào)節(jié)很多生理過程，包括蛋白質(zhì)合成、核糖體生物合成及自噬作用等[12-13]。本課題組前期研究表明，Arg濃度影響豬腸上皮細(xì)胞營養(yǎng)核心通路mTOR信號通路及蛋白質(zhì)合成的信號通路，適宜提高Arg濃度通過激活mTOR信號通路降低蛋白質(zhì)降解，有助于提高細(xì)胞增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑Rap能極顯著降低豬上皮細(xì)胞增殖，提高Arg濃度可通過提高細(xì)胞增殖率緩解mTOR抑制對細(xì)胞的損傷。本課題組前期研究還表明，mTOR信號通路的激活是Arg緩解細(xì)胞應(yīng)激損傷的重要機(jī)制[4]，其中Arg分解代謝產(chǎn)物如多胺和NO可能參與對DNA的修復(fù)作用[15]，促進(jìn)細(xì)胞周期的正常進(jìn)程[16]。此外，Arg也能有效緩解LPS對豬腸上皮細(xì)胞周期的抑制作用[5]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加Rap抑制mTOR信號通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期，然而提高Arg濃度并不能改善Rap對細(xì)胞周期的抑制作用。由于提高Arg濃度能促進(jìn)細(xì)胞周期中S期細(xì)胞數(shù)量且激活mTOR信號通路[5]，猜測Arg可能主要通過mTOR信號通路來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞周期的調(diào)控，因此mTOR信號通路被抑制后即使提高培養(yǎng)基中的Arg濃度也不能有效緩解Rap對細(xì)胞周期的抑制作用。mTORC1激活后能調(diào)節(jié)下游效應(yīng)，主要的下游信號為核糖體S6激酶(S6K)和4EBP，S6K和4EBP主要用來調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯合成[12]。本研究發(fā)現(xiàn)添加Rap后PI3K-Akt信號通路被抑制，而提高Arg濃度可有效緩解Rap帶來的抑制作用。

細(xì)胞凋亡受到Bcl2家族、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族以及癌基因如p53等多基因調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)添加Rap極顯著降低了細(xì)胞凋亡率，抑制豬腸上皮細(xì)胞的凋亡。Hosoi等[17]的研究表明，在人橫紋肌肉瘤細(xì)胞中Rap誘導(dǎo)非p53依賴的細(xì)胞凋亡。本研究顯示，長期的Rap處理抑制細(xì)胞增殖，減少了細(xì)胞自發(fā)性的凋亡；提高Arg濃度緩解了Rap對豬腸上皮細(xì)胞增殖的抑制作用；提高Arg濃度對細(xì)胞周期沒有顯著影響，猜測提高Arg濃度可能通過影響細(xì)胞的凋亡來緩解Rap的抑制作用；同時(shí)，提高Arg濃度加強(qiáng)了對細(xì)胞凋亡的抑制。Cyt-C對啟動(dòng)細(xì)胞凋亡起著重要作用，從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。本試驗(yàn)檢測了Cyt-C的蛋白表達(dá)量，添加Rap降低了Cyt-C的蛋白表達(dá)量。Bcl2家族和Caspase家族蛋白也是調(diào)控凋亡的重要蛋白。Bcl2家族蛋白可以分為兩大類：第1類為抗凋亡蛋白，主要有Bcl2、Bcl-xL、B細(xì)胞淋巴瘤-W(Bcl-W)等；第2類為促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bcl2拮抗/殺傷因子(Bak)、B細(xì)胞淋巴瘤-XS(Bcl-XS)、Bcl-xL/Bcl2相關(guān)死亡促進(jìn)因子(Bad)、BH3結(jié)構(gòu)域凋亡激動(dòng)劑(Bid)等[18-20]。Rap提高抗凋亡蛋白Bcl-xL的蛋白表達(dá)量，同時(shí)抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase 3的蛋白表達(dá)量，從而抑制豬腸上皮細(xì)胞凋亡，提高Arg濃度加劇抑制凋亡，緩解細(xì)胞損傷。

本研究中，外源性添加高濃度Arg顯著提高Arg的攝取率。Arg的轉(zhuǎn)運(yùn)主要是通過細(xì)胞膜上的特殊陽性轉(zhuǎn)運(yùn)載體——y+(包括CAT1、CAT2、CAT3、CAT4載體蛋白)、B0+(ATB0+)、b0+(b0+AT)以及y+L(包括y+LAT1、y+LAT2載體蛋白)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的[20]。Rap促進(jìn)了Arg轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT2的蛋白及mRNA表達(dá)，降低了LAT1的mRNA以及CAT1和LAT1的蛋白及mRNA表達(dá)，暗示著提高Arg轉(zhuǎn)運(yùn)主要?dú)w功于CAT2和LAT1的表達(dá)。CAT2主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)入Arg，而LAT1負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)出Arg。因此增加的CAT2和降低的LAT1促使了Arg的攝取。Visigalli等[8]發(fā)現(xiàn)，在人內(nèi)皮細(xì)胞中Rap能通過CAT2來刺激Arg的轉(zhuǎn)運(yùn)。在大鼠的骨骼肌中，CAT2A在應(yīng)激狀況下被激活，如外科手術(shù)創(chuàng)傷或是食物缺乏。這就意味著CAT2A可能作為從蛋白質(zhì)分解出的Arg的輸出通道?？紤]到mTOR復(fù)合物分為mTORC1和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)，大部分時(shí)候只有mTORC1對Rap敏感，而mTORC2對其不敏感。長期的Rap處理可以降低mTORC2的活性。Rap可能通過影響mTORC1的表達(dá)，從而提高mTORC2的活性來促使CAT2的表達(dá)。上述結(jié)果表明，長期的Rap處理抑制細(xì)胞PI3K-Akt信號通路及mTORC2的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)結(jié)果顯示添加Rap后CAT2、PKCα和Erk的蛋白表達(dá)量隨之上升。由此可以說明，細(xì)胞在處于Rap應(yīng)激的狀況下生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)通過mTOR信號通路促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長。因此，抑制mTOR信號通路將會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)減少[21]。綜合以前的試驗(yàn)結(jié)果，CAT1表達(dá)與營養(yǎng)刺激有關(guān)，隨著mTOR信號通路的活性變化，而只有CAT2的表達(dá)受到極端環(huán)境的刺激[21]。Rap處理下細(xì)胞內(nèi)的Arg攝取增加主要取決于CAT2的蛋白表達(dá)量增加及mTOR信號通路被抑制而引起的蛋白質(zhì)的水解[8]。由于提高Arg濃度后CAT2的蛋白表達(dá)量下降，但是細(xì)胞內(nèi)的Arg轉(zhuǎn)運(yùn)和Arg的濃度都比對照組要高，因此可能存在一個(gè)未知的通路影響著Arg的攝取。Visigalli等[8]發(fā)現(xiàn)，添加腫瘤壞死因子-α(TNF-α)也能通過提高CAT2的蛋白表達(dá)量來提高Arg的轉(zhuǎn)運(yùn)，這主要是通過激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路來實(shí)現(xiàn)，同時(shí)也與TNF-α激活PI3K-Akt-mTOR信號通路有關(guān)；此外，同時(shí)添加Rap和TNF-α能更進(jìn)一步提高Arg的轉(zhuǎn)運(yùn)。由此推測，在Rap添加后細(xì)胞可能通過激活NF-κB信號通路來激活CAT2的表達(dá)。本試驗(yàn)同時(shí)檢測到轉(zhuǎn)錄因子Erk和cFos的蛋白表達(dá)量上升。因此，推測Rap抑制mTOR信號通路，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解增加，細(xì)胞激活PI3K-Akt信號通路來抑制凋亡，而Rap應(yīng)激使得轉(zhuǎn)錄因子Erk、cFOS處于高表達(dá)水平，從而進(jìn)入細(xì)胞核參與CAT2的轉(zhuǎn)錄使其表達(dá)量上升，從而使得細(xì)胞內(nèi)的Arg濃度上升，這是細(xì)胞的一種對環(huán)境刺激而產(chǎn)生的反饋機(jī)制。激活PKCα-Erk/cFos-CAT2信號通路，使得Arg濃度上升，CAT2的蛋白表達(dá)量極顯著上升，促進(jìn)Arg轉(zhuǎn)運(yùn)，緩解細(xì)胞損傷。這些結(jié)論還需要設(shè)計(jì)更進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

① Rap顯著抑制豬腸上皮細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，抑制mTOR信號通路，提高Arg濃度可有效緩解Rap對細(xì)胞增殖的抑制。

② Rap通過激活PI3K-Akt-Bcl2信號通路抑制細(xì)胞凋亡。

③ Rap可能通過PKCα-Erk/cFos-CAT2信號通路調(diào)控CAT2的表達(dá)，從而促進(jìn)Arg的攝取，修復(fù)細(xì)胞損傷。