郭 濤 黃右琴 代露茗 郭 龍 李發(fā)弟，2 潘發(fā)明 張兆杰 李 飛*

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730020；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，民勤 733300；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070；4.景泰縣草窩灘鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，白銀 730400)

苜蓿屬多年生豆科植物，與其他常用粗飼料相比，苜蓿營養(yǎng)價(jià)值較高，是含有高蛋白質(zhì)、高可消化纖維的優(yōu)質(zhì)粗飼料之一[1]。王玲[2]研究表明，飼糧中添加一定量的苜蓿干草能夠提高奶牛產(chǎn)奶量，并且在添加6 kg/d時(shí)經(jīng)濟(jì)效益最高。我國苜蓿種植面積約占全球總面積的15.1%，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年我國苜蓿單產(chǎn)量為7 t/hm2，且總產(chǎn)量達(dá)2 933.6萬t。其中，我國苜蓿種植區(qū)域主要集中在西北區(qū)域，產(chǎn)量約占全國產(chǎn)量的77.6%[3]。苜蓿干草資源豐富，利用傳統(tǒng)的濕化學(xué)分析評(píng)定其營養(yǎng)價(jià)值耗時(shí)耗力，并且所用試劑對(duì)環(huán)境有一定的污染。如何高效合理的利用苜蓿資源是一個(gè)亟待解決的問題。

從20世紀(jì)90年代開始，近紅外光譜(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)技術(shù)發(fā)展迅速，其具有綠色、便捷、無污染的特點(diǎn)，是快速評(píng)定飼料營養(yǎng)價(jià)值的方式之一[4]。根據(jù)待測物質(zhì)中不同含氫基團(tuán)化學(xué)鍵的泛頻振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，在近紅外區(qū)域獲得光譜信息，通過化學(xué)計(jì)量學(xué)手段建立光譜與營養(yǎng)成分含量之間的線性和非線性模型，從而實(shí)現(xiàn)光譜對(duì)待測營養(yǎng)成分含量的快速預(yù)測[5-6]。何云等[7]利用近紅外光譜技術(shù)構(gòu)建了粉碎苜蓿干草干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、粗脂肪(ether extract，EE)和粗灰分(crude ash，Ash)等營養(yǎng)成分含量的近紅外預(yù)測模型。為進(jìn)一步探究粒徑對(duì)苜蓿干草近紅外預(yù)測模型預(yù)測準(zhǔn)確性的影響，本研究以切短和粉碎苜蓿干草為研究對(duì)象，利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合濕化學(xué)分析值分別建立樣品常規(guī)營養(yǎng)成分含量的近紅外預(yù)測模型，并且分析這2種處理方式下各營養(yǎng)成分含量預(yù)測模型的預(yù)測偏差，旨在為快速評(píng)定苜蓿干草營養(yǎng)價(jià)值提供便捷，也為生產(chǎn)實(shí)踐中更高效合理地利用苜蓿資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與制備

于2018年10月至2019年10月在甘肅、寧夏、河北、江蘇和陜西5個(gè)省份和自治區(qū)采集不同品種、不同茬次的苜蓿干草樣品186份。采集的樣品先用鍘刀切成3～5 cm，裝入采樣袋，帶回實(shí)驗(yàn)室，利用四分法將其分為2部分，一部分封存于真空包裝袋用于近紅外光譜儀(FOSS-DS2500，丹麥)掃描；另一部分用切割式粉碎機(jī)儀(CM100，北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司)粉碎，過1 mm篩，封存于自封袋，用于近紅外光譜儀掃描和濕化學(xué)分析。

1.2 苜蓿干草營養(yǎng)成分測定

苜蓿干草DM和Ash含量分別按照GB/T 6435—2006和GB/T 6438—2007方法使用全自動(dòng)水分灰分儀(prepASH-340，瑞士)測定[8]，CP含量按照GB/T 6432—2018方法使用全自動(dòng)凱氏定氮儀(FOSS-8400，丹麥)測定[9]，NDF和ADF含量按照Van Soest等[10]方法使用全自動(dòng)纖維儀(Ringbio R-2000，英國)測定，EE含量按照GB/T 6433—2006方法使用全自動(dòng)脂肪儀(ANKOM XT-15i，美國)測定[11]。

1.3 苜蓿干草近紅外分析

1.3.1 苜蓿干草不同處理方式近紅外光譜圖的采集

利用四分法將所采集到的切短為3～5 cm的苜蓿干草樣品裝入樣品杯中(樣品杯容積的1/3～2/3)掃描，重復(fù)裝樣掃描3次，取3次得到的平均光譜為該樣品的原始光譜。粉碎過1 mm篩的苜蓿干草樣品在自封袋中混勻，裝入樣品杯中(樣品杯容積的1/3～2/3)掃描，重復(fù)裝樣掃描3次，取3次掃描得到的平均光譜為該樣品的原始光譜。分別取所有切短和粉碎過1 mm篩苜蓿干草樣品的平均光譜，如圖1所示，可知在某一特定的波長位置，近紅外光對(duì)不同處理方式的苜蓿干草樣品都有相似的吸收作用，但是吸收強(qiáng)度不同。在橫軸上，同一苜蓿干草樣品不同營養(yǎng)成分在不同波長處的吸收強(qiáng)度不同，有多處吸收峰，為定量分析各營養(yǎng)成分含量奠定了基礎(chǔ)。

圖1 切短和粉碎苜蓿干草樣品原始光譜圖

切短和粉碎樣品一階和二階導(dǎo)數(shù)處理光譜圖分別如圖2和圖3。由圖可知，苜蓿干草樣品不同處理方式所得近紅外光譜圖經(jīng)一階和二階導(dǎo)數(shù)處理之后，特征譜峰增多，有消除背景信息和基線漂移等作用。此外，經(jīng)一階和二階導(dǎo)數(shù)處理之后，在某一特定波長處切短苜蓿干草樣品比粉碎苜蓿干草樣品有更高峰值，解析出更多信息。

圖2 切短和粉碎苜蓿干草樣品一階導(dǎo)數(shù)處理光譜圖

圖3 切短和粉碎苜蓿干草樣品二階導(dǎo)數(shù)處理光譜圖

1.3.2 不同處理方式的苜蓿干草近紅外預(yù)測模型的建立與驗(yàn)證

利用WinISI Ⅲ軟件對(duì)近紅外光譜儀所采集到的切短和粉碎苜蓿干草樣品的近紅外原始光譜圖進(jìn)行處理，分別結(jié)合濕化學(xué)分析值構(gòu)建各自的定標(biāo)模型。各種營養(yǎng)成分在建立定標(biāo)模型之前，其按照營養(yǎng)成分含量的升序排列，按照4∶1比例，將樣品分為定標(biāo)集(n=149)和驗(yàn)證集(n=37)，利用主成分分析(principal component analysis，PCA)和改良偏最小二乘法(modified partial least squares，MPLS)相結(jié)合的方式建立各營養(yǎng)成分預(yù)測模型。

在建立模型過程中，使用全局距離(GH)≥3和T值(T)>2.5超常樣品為剔除限，剔除超常樣品。若GH>3，則表示該樣品的偏差大于定標(biāo)集樣品偏差的3倍，進(jìn)行剔除；若T>2.5，則表示預(yù)測結(jié)果和濕化學(xué)分析值的差大于定標(biāo)誤差的2.5倍，該樣品進(jìn)行剔除或者重新進(jìn)行濕化學(xué)分析。為了消除無關(guān)因素的干擾，采用3種導(dǎo)數(shù)處理(0,0,1,1、1,4,4,1和2,4,4,1)和7種散射校正相結(jié)合對(duì)原始光譜進(jìn)行處理。7種散射校正包括：無處理(none)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variate，SNV)、去散射(detrend only)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換和散射處理(standard normal variate and detrend，SNV and detrend)、加權(quán)多元散射校正(weighted multiplicative scattering correction，weighted MSC)、標(biāo)準(zhǔn)多元散射校正(standard multiplicative scattering correction，standard MSC)、反向多元散射校正(inverse multiplicative scattering correction，inverse MSC)。然后以最大的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(1 minus the variance ration，1-VR)和最小的交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error of cross validation，SECV)為依據(jù)，確定各自最優(yōu)定標(biāo)模型。

對(duì)于所建立且篩選的各營養(yǎng)成分最優(yōu)定標(biāo)模型采用外部驗(yàn)證進(jìn)一步確定模型的優(yōu)劣。若預(yù)測決定系數(shù)(coefficient of determination for validation，RSQ)越接近于1，說明建立的預(yù)測模型的預(yù)測效果越好；若0

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，利用SPSS 25.0進(jìn)行分析。2種處理方式下各營養(yǎng)成分含量近紅外預(yù)測模型預(yù)測偏差采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。分析結(jié)果表示方法為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 苜蓿干草各營養(yǎng)成分含量濕化學(xué)分析

由表1可知，苜蓿干草定標(biāo)集DM、Ash、CP、NDF、ADF、EE含量分別為88.73%～95.25%、5.88%～17.99%、9.22%～22.04%、33.47%～68.15%、21.64%～55.23%、1.08%～3.74%，平均值分別為92.98%、10.69%、16.11%、48.05%、34.84%、2.43%。苜蓿干草驗(yàn)證集DM、Ash、CP、NDF、ADF、EE含量分別為89.71%～94.79%、6.67%～14.99%、9.92%～24.44%、34.69%～72.65%、23.33%～57.22%、1.33%～3.40%，平均值分別為92.93%、10.55%、16.31%、48.32%、35.11%、2.40%。

表1 苜蓿干草定標(biāo)集和驗(yàn)證集各營養(yǎng)成分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 切短和粉碎苜蓿干草各營養(yǎng)成分定標(biāo)模型的建立與優(yōu)化

利用WinISI Ⅲ軟件將苜蓿干草6種營養(yǎng)成分濕化學(xué)分析值分別與切短、粉碎苜蓿干草近紅外光譜數(shù)據(jù)相結(jié)合建立定標(biāo)模型。以導(dǎo)數(shù)處理和去散射處理相結(jié)合方式對(duì)每種濕化學(xué)分析指標(biāo)獨(dú)立定標(biāo)。切短和粉碎苜蓿干草6種營養(yǎng)成分定標(biāo)最優(yōu)組合分別見表2和表3。由表2可知，不同營養(yǎng)成分最優(yōu)光譜處理和導(dǎo)數(shù)處理的選擇不同，定標(biāo)之后有不同的1-VR和SECV。切短苜蓿干草DM、Ash、CP、NDF、ADF、EE的光譜處理和導(dǎo)數(shù)處理最優(yōu)組合分別為SNV and detrend和1,4,4,1、standard MSC和2,4,4,1、detrend only和0,0,1,1、SNV和1,4,4,1、detrend only和2,4,4,1、weighted MSC和2,4,4,1。各營養(yǎng)成分定標(biāo)模型的SECV和1-VR如下：DM為0.583 7和0.752 9，Ash為0.975 1和0.599 0，CP為1.619 8和0.668 8，NDF為3.631 2和0.721 1，ADF為3.051 0和0.758 4，EE為0.425 2和0.183 6。

表2 切短苜蓿干草各營養(yǎng)成分最佳定標(biāo)模型

由表3可知，粉碎苜蓿干草DM、Ash、CP、NDF、ADF、EE的光譜處理和導(dǎo)數(shù)處理最優(yōu)組合分別為none和1,4,4,1、SNV and detrend和1,4,4,1、weighted MSC和0,0,1,1、weighted MSC和1,4,4,1、detrend only和2,4,4,1、standard MSC和1,4,4,1。各營養(yǎng)成分定標(biāo)模型的SECV和1-VR如下：DM為0.290 2和0.932 2，Ash為0.683 3和0.817 4，CP為1.230 8和0.807 9，NDF為2.152 7和0.902 6，ADF為1.592 9和0.934 7，EE為0.349 0和0.390 7。

表3 粉碎苜蓿干草各營養(yǎng)成分最佳定標(biāo)模型

2.3 切短和粉碎苜蓿干草各營養(yǎng)成分最優(yōu)定標(biāo)模型的驗(yàn)證

切短和粉碎苜蓿干草各營養(yǎng)成分定標(biāo)模型建立之后，需要用驗(yàn)證集樣品對(duì)利用最優(yōu)組合建立的定標(biāo)模型進(jìn)行驗(yàn)證。切短和粉碎苜蓿干草各營養(yǎng)成分外部驗(yàn)證結(jié)果見表4和表5。由表4可知，切短苜蓿干草NDF最優(yōu)定標(biāo)模型RSQ和RPD分別為0.86和2.63，建立的定標(biāo)模型可用于精確預(yù)測；DM、ADF最優(yōu)定標(biāo)模型RSQ和RPD分別為0.67和1.61、0.75和1.99，建立的定標(biāo)模型可用于實(shí)際生產(chǎn)中的預(yù)測；Ash、CP最優(yōu)定標(biāo)模型RSQ和RPD分別為0.61和1.48、0.64和1.65，建立的定標(biāo)模型只能粗略的篩選樣品，不能用于實(shí)際生產(chǎn)中的預(yù)測；EE最優(yōu)定標(biāo)模型RSQ和RPD分別為0.13和1.07，定標(biāo)模型不可用。

表4 切短苜蓿干草各營養(yǎng)成分最佳定標(biāo)模型外部驗(yàn)證結(jié)果

由表5可知，粉碎苜蓿干草DM、NDF、ADF最優(yōu)定標(biāo)模型RSQ都高于0.83，且RPD高于2.50，建立的定標(biāo)模型可用于精確預(yù)測；Ash最優(yōu)定標(biāo)模型RSQ高于0.66，且RPD高于2.00，建立的定標(biāo)模型可用于實(shí)際生產(chǎn)中的預(yù)測；CP和EE最優(yōu)定標(biāo)模型RSQ高都于0.50，但RPD低于2.00，建立的定標(biāo)模型只能粗略的篩選樣品，不能用于實(shí)際生產(chǎn)中的預(yù)測。

表5 粉碎苜蓿干草各營養(yǎng)成分最佳定標(biāo)模型外部驗(yàn)證結(jié)果

由表6可知，切短苜蓿干草和粉碎苜蓿干草的CP、NDF、ADF、EE、DM和Ash定標(biāo)模型的預(yù)測偏差無顯著差異(P>0.05)。

表6 苜蓿干草不同處理方式近紅外定標(biāo)模型預(yù)測偏差分析

3 討 論

近紅外光譜技術(shù)在分子水平上為飼料原料提供了光譜數(shù)據(jù)，可預(yù)測待測物的營養(yǎng)成分含量[14]。Norris等[15]建立的飼草常規(guī)營養(yǎng)成分近紅外預(yù)測模型可預(yù)測其各營養(yǎng)成分含量，證實(shí)了利用近紅外光譜技術(shù)可以快速有效地評(píng)定飼草營養(yǎng)價(jià)值的可行性。自此，近紅外光譜技術(shù)在飼料營養(yǎng)價(jià)值評(píng)定領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。迄今為止，已廣泛的用于預(yù)測飼料原料營養(yǎng)成分分析[16-20]、全混合日糧營養(yǎng)成分分析[21]、天然牧場新鮮飼草營養(yǎng)成分分析[22]和糞樣的分析[23-25]等各個(gè)領(lǐng)域。Pérez-Vich等[26]以葵花籽、去殼葵花仁、葵花籽粉和葵花油為研究對(duì)象，測定了其脂肪含量和脂肪酸組成，利用近紅外光譜技術(shù)建立不同處理方式預(yù)測模型，結(jié)果表明葵花籽的相關(guān)系數(shù)較低(0.76～0.85)，去殼葵花仁、葵花籽粉和葵花油的相關(guān)系數(shù)相差不大，并且認(rèn)為利用葵花籽測定可以最大限度的獲得較高的準(zhǔn)確性[27]。

樣品散射系數(shù)與樣品粒徑有關(guān)，粒徑越大，其散射系數(shù)越小。根據(jù)Kubellka-Munk函數(shù)，散射系數(shù)越小，吸光度越大，得到的樣品的光譜會(huì)上移，因此得到的切短苜蓿干草的光譜會(huì)上移[28]。雖然同一樣品不同粒徑對(duì)近紅外光的吸收不同，但是分別經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)處理之后，消除了苜蓿干草樣品對(duì)近紅外光有不同吸收程度的影響。切短和粉碎苜蓿干草的DM和Ash預(yù)測模型預(yù)測偏差無顯著差異，但預(yù)測模型RSQ和RPD都低于粉碎苜蓿干草，且預(yù)測偏差都高于粉碎苜蓿干草近紅外預(yù)測模型，因此利用近紅外光譜技術(shù)可直接預(yù)測切短苜蓿干草的DM和Ash含量，但預(yù)測準(zhǔn)確性低于粉碎苜蓿干草。切短苜蓿干草較粉碎苜蓿干草的CP、NDF、ADF和EE預(yù)測模型預(yù)測偏差無顯著差異，與唐開婷[29]研究結(jié)果相同。粉碎苜蓿干草的CP、NDF和ADF預(yù)測模型預(yù)測準(zhǔn)確性優(yōu)于唐開婷[29]研究結(jié)果，而切短苜蓿干草的CP、NDF和ADF預(yù)測模型預(yù)測準(zhǔn)確性低于唐開婷[29]研究結(jié)果，原因可能為近紅外光對(duì)不同粒徑的苜蓿干草的穿透能力和反射能力不同，粒徑的變化致使近紅外光在樣品內(nèi)部傳播的光程發(fā)生變化，影響苜蓿干草對(duì)近紅外光的吸收和散射[28]。

粉碎苜蓿干草的CP、NDF和ADF預(yù)測模型預(yù)測準(zhǔn)確性優(yōu)于切短碎苜蓿干草，原因可能為苜蓿干草中葉片所含蛋白質(zhì)含量較莖稈高，約占粗蛋白質(zhì)總含量的70%左右；莖稈所含中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量較葉片高；將切短樣品裝入樣品杯之后，葉片易在樣品杯底部，而粉碎苜蓿干草莖葉經(jīng)粉碎之后樣品混合均勻，有利于樣品對(duì)近紅外光的吸收。粉碎和切短2種處理方式各自的EE預(yù)測模型的預(yù)測值與濕化學(xué)分析值的相關(guān)性都較差，與劉哲[30]研究結(jié)果一致。但粉碎苜蓿干草的EE預(yù)測模型RSQ高于切短苜蓿干草，可能的原因一方面為粉碎比切短處理樣品混合更為均勻，對(duì)于近紅外光對(duì)樣品的漫反射影響較小，光譜能采集到的更多的數(shù)據(jù)信息；另一方面，本研究所用的濕化學(xué)分析樣品為粉碎過1 mm篩，在利用4分法分切短至3～5 cm樣品時(shí)，有一定的誤差。建立近紅外預(yù)測模型預(yù)測飼草營養(yǎng)成分含量不是一個(gè)簡單的過程，而是需要不斷地更新和優(yōu)化[31]。

4 結(jié) 論

① 利用近紅外光譜技術(shù)建立的切短苜蓿干草NDF預(yù)測模型可用于精確預(yù)測，DM和ADF預(yù)測模型可用于實(shí)際生產(chǎn)中的預(yù)測，Ash和CP預(yù)測模型只能用于粗略的篩選分析，EE預(yù)測模型不可用。

② 利用近紅外光譜技術(shù)建立的粉碎苜蓿干草DM、NDF和ADF預(yù)測模型可用于精確預(yù)測，Ash預(yù)測模型可用于實(shí)際生產(chǎn)中的預(yù)測，CP和EE預(yù)測模型只能用于粗略的篩選分析。

③ 利用近紅外光譜技術(shù)建立的切短苜蓿干草營養(yǎng)成分預(yù)測模型的預(yù)測偏差與粉碎苜蓿干草無顯著差異，但RSQ和RPD低于粉碎苜蓿干草，說明切短苜蓿干草營養(yǎng)成分定標(biāo)模型預(yù)測分析準(zhǔn)確性低于粉碎苜蓿干草。