江 維，李 宇，韋 巍，張淑群，李宗芳*

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤外科，生物診斷治療國家地方聯(lián)合工程研究中心，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科，陜西 西安 710004)

隨著傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)模型向生物-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式逐漸轉(zhuǎn)變，證實(shí)慢性應(yīng)激與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，給予腫瘤患者心理治療、社會(huì)支持、針對(duì)慢性應(yīng)激的藥物治療均可以改善患者的預(yù)后[1]。基礎(chǔ)研究證實(shí),慢性應(yīng)激通過應(yīng)激激素(腎上腺素、去甲腎上腺素、糖皮質(zhì)激素等)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而免疫因素在慢性應(yīng)激促腫瘤進(jìn)展中具有重要作用[2-3]。高表達(dá)趨化因子受體2(chemokine receptor 2,CCR2)的單核細(xì)胞趨化至腫瘤組織將分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAM)，而TAM通過多種途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道慢性應(yīng)激通過增加體內(nèi)CCR2+單核細(xì)胞的比例進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[5]。脾臟在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。臨床研究表明，外傷脾切除會(huì)增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，而切除病理脾臟(如門靜脈高壓癥脾功能亢進(jìn)的脾臟)能降低肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。脾臟是單核巨噬細(xì)胞的重要來源之一，同時(shí)也是腫瘤免疫耐受發(fā)生的部位，在腫瘤進(jìn)展期切除脾臟可以減少腫瘤組織中單核巨噬細(xì)胞的數(shù)量，提高CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，抑制腫瘤的生長[8-9]。由此可見，脾臟參與了腫瘤的進(jìn)展，但脾臟在慢性應(yīng)激促腫瘤進(jìn)展中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探討脾臟在慢性應(yīng)激促肝癌進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雄性C57BL/6小鼠28只，體重(20±2)g，為SPF級(jí)，購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) H22細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。H22細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(購自Gibco)、1%青霉素-鏈霉素溶液(購自碧云天公司)的1640完全培養(yǎng)基中(購自Hyclone公司)，在5%CO2、37 ℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用15 mL離心管收集起來，于1 000 r/min 常溫離心5 min，棄掉上清，用生理鹽水重懸，備用。

1.3主要抗體 大鼠抗小鼠PE/Cyanine7-labeled CCR2、大鼠抗小鼠PE-labeled Ly6C、大鼠抗小鼠CD16/32、大鼠抗小鼠APC-labeled CD11b、大鼠抗小鼠Brilliant Violet 421TM-labeled CD45抗體購自美國Biolegend公司。

1.4慢性束縛應(yīng)激荷瘤小鼠模型的建立 待小鼠適應(yīng)環(huán)境2周后，慢性應(yīng)激小鼠給予束縛應(yīng)激，2 h/d，應(yīng)激方法是將小鼠水平束縛在通氣的50 mL離心管中。應(yīng)激5 d后皮下接種H22肝癌細(xì)胞建立皮下瘤模型。其具體方法為：將上述復(fù)蘇并培養(yǎng)了24 h后的H22肝癌細(xì)胞用生理鹽水重懸，并調(diào)整H22細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，吸取0.1 mL細(xì)胞懸液，無菌注射到小鼠腹腔內(nèi)，等待小鼠出現(xiàn)大量腹腔積液后，無菌取出小鼠腹腔積液至15 mL離心管中，用生理鹽水洗滌2次，每次洗后1 000 r/min離心5 min，去上清，用12 mL生理鹽水重懸細(xì)胞，并將H22肝癌細(xì)胞稀釋至5×106個(gè)/mL。用1 mL注射器小鼠左側(cè)腹股溝處30度角度緩慢刺入皮下，并斜行進(jìn)針1 cm左右后注入100 μL H22細(xì)胞懸液，見注射部位出現(xiàn)小皮丘，無漏液，證明注射成功。緩慢拔出注射器，用棉簽輕壓進(jìn)針口1 min左右。接種腫瘤后繼續(xù)應(yīng)激21 d。

1.5脾切除及假手術(shù) 為了排除手術(shù)的影響，于慢性應(yīng)激前2周行脾切除或假手術(shù)，在紫外線滅菌后的環(huán)境下，腹腔注射4%水合氯醛(0.01 mL/g體重)麻醉小鼠，備皮并用碘伏消毒3遍，取腹部正中切口長約0.8 cm，充分暴露脾臟，分別用縫合線結(jié)扎脾臟上極和下極的血管后剪掉血管，最后將脾臟游離下來并摘除。檢測血管結(jié)扎處是否有出血后，逐層縫合腹腔，碘伏消毒皮層后將小鼠側(cè)臥保溫復(fù)蘇。假手術(shù)僅打開腹腔，不做脾切除術(shù)，直接縫合腹腔。

1.6外周血及腫瘤單細(xì)胞懸液制備 小鼠接種腫瘤3周后用眼球取血法采血約1.0 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中備用，并取其腫瘤組織稱重。將上述所取乙二胺四乙酸抗凝血加入5 mL紅細(xì)胞裂解液充分混勻，冰上孵育5 min，用含2 %胎牛血清的PBS 10 mL終止，4 ℃下350 g離心5 min，取沉淀細(xì)胞并用1 mL PBS重懸,計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1×107～2×107個(gè)/mL，放置于冰上，備用。將獲取的腫瘤組織用眼科剪剪碎，并加入DNaseⅠ(購自上海生工生物)和Ⅳ型膠原酶(購自上海生工生物)，使其終濃度分別為1.5 g/L和3 g/L，于37 ℃下孵育30 min，并用200目尼龍網(wǎng)過濾，以獲得單個(gè)細(xì)胞，4 ℃下350 g離心5 min，棄去上清液取沉淀細(xì)胞；用1 mL PBS重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1×107～2×107個(gè)/mL，放置于冰上，備用。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤和外周血CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的比例 吸取100 μL上述制備的細(xì)胞懸液加入流式管中，用抗大鼠抗小鼠CD16/32抗體4 ℃孵育15 min，按說明書加入適量的CCR2、Ly6C、CD11b、CD45抗體，4 ℃避光孵育30 min，后加入含1%胎牛血清的PBS 2 mL，4 ℃下350 g離心5 min，棄去上清液；重復(fù)1次，最后加入0.5 mL PBS重懸，用FACS Canto Ⅱ flow cytometer(美國BD公司)檢測結(jié)果。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1慢性應(yīng)激對(duì)肝癌進(jìn)展的影響 采取接種腫瘤前連續(xù)束縛應(yīng)激5 d，接種腫瘤后再連續(xù)束縛應(yīng)激21 d的慢性應(yīng)激模型探討慢性應(yīng)激對(duì)肝癌進(jìn)展的影響(圖1)，結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤重量為(0.109±0.040) g，應(yīng)激組腫瘤重量為(0.283±0.047) g，應(yīng)激組腫瘤重量明顯大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.810，P=0.023)。

圖1 慢性應(yīng)激對(duì)肝癌進(jìn)展的影響

2.2慢性應(yīng)激對(duì)CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的影響 因CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測慢性應(yīng)激對(duì)荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞比例的影響。結(jié)果顯示，應(yīng)激組外周血CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的比例明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)；對(duì)照組和應(yīng)激組腫瘤組織CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖2 慢性應(yīng)激對(duì)外周血CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的影響

表1 慢性應(yīng)激對(duì)荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的影響Table 1 The impact of chronic stress on the proportion of CD11b+Ly6C+CCR2+ monocyte in the peripheral blood and tumor tissue of tumor-bearing mice

2.3脾臟在慢性應(yīng)激促肝癌進(jìn)展中的作用 用脾切除的手段探討脾臟在慢性應(yīng)激促肝癌進(jìn)展中的作用。結(jié)果顯示，假手術(shù)應(yīng)激組腫瘤重量明顯高于假手術(shù)組和脾切除應(yīng)激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 假手術(shù)組和脾切除應(yīng)激組腫瘤重量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 脾臟在慢性應(yīng)激促肝癌進(jìn)展中的作用Table 2 The role of the spleen in progression of hepatic carcinoma induced by chronic stress

2.4脾切除對(duì)慢性應(yīng)激荷瘤小鼠CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的影響 檢測脾切除對(duì)慢性應(yīng)激荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞比例的影響。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組(7.65±0.78)%相比，假手術(shù)應(yīng)激組外周血CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的比例明顯高于假手術(shù)組和脾切除應(yīng)激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),假手術(shù)組和脾切除應(yīng)激組外周血CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組、假手術(shù)應(yīng)激組和脾切除應(yīng)激組腫瘤組織CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 脾切除對(duì)慢性應(yīng)激荷瘤小鼠CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的影響Table 3 The impact of splenectomy on the proportion of CD11b+Ly6C+CCR2+ monocyte in chronic stressed tumor-bearing mice

3 討 論

研究證實(shí)，慢性應(yīng)激能通過抑制腫瘤的免疫微環(huán)境促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[10]。高表達(dá)CCR2的單核細(xì)胞是腫瘤免疫微環(huán)境的重要組成部分，其分化為TAM，而TAM通過多種途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[4]。慢性應(yīng)激通過增加體內(nèi)CCR2+單核細(xì)胞的比例促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Armaiz-Pena等[3]研究表明，慢性束縛應(yīng)激通過交感神經(jīng)系統(tǒng)上調(diào)腫瘤細(xì)胞表達(dá)CCL2，進(jìn)而趨化單核巨噬細(xì)胞到腫瘤組織促進(jìn)腫瘤生長；Chen等[5]研究結(jié)果表明，慢性應(yīng)激通過交感神經(jīng)系統(tǒng)上調(diào)肺組織表達(dá)CCL2，從而通過CCL2-CCR2通路趨化單核巨噬細(xì)胞到轉(zhuǎn)移灶，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。本研究證實(shí)，慢性束縛應(yīng)激促進(jìn)肝癌進(jìn)展并增加外周血CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的比例，由此可見，慢性應(yīng)激可能通過增加CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的比例促進(jìn)肝癌進(jìn)展，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，也是重要的髓外造血部位，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，比如腫瘤、肝炎肝硬化、心腦血管疾病等[11-14]。脾臟對(duì)腫瘤的作用還未有定論，有的研究表明切除脾臟能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[15-16]，有的研究表明切除脾臟對(duì)腫瘤的生長沒有影響[17-18]。前期研究結(jié)果顯示，脾切除能夠抑制腫瘤進(jìn)展[19-20]。不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是由不同的動(dòng)物模型和不同的切脾時(shí)間造成的，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。最近研究結(jié)果顯示，脾臟作為一個(gè)重要的髓外造血的器官，是單核巨噬細(xì)胞的重要來源之一，荷瘤小鼠脾臟顯著增大，脾臟同時(shí)是腫瘤免疫耐受的發(fā)生部位[8,21]。切除脾臟能抑制腫瘤的生長和減少單核巨噬細(xì)胞的數(shù)量[8-9]。前期研究表明，肝纖維化模型大鼠較正常大鼠脾臟中CCR2+單核巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，肝纖維化模型大鼠切脾后肝臟單核巨噬細(xì)胞數(shù)量降低，說明脾臟是CCR2+單核細(xì)胞的重要來源之一[22]。慢性應(yīng)激能促進(jìn)脾臟中的單核巨噬細(xì)胞分布到外周器官，而慢性應(yīng)激能招募脾臟中的單核細(xì)胞到小鼠大腦[23-25]。本研究結(jié)果顯示，在造模前14 d切除脾臟能減緩慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的腫瘤生長，也能顯著減少慢性應(yīng)激小鼠外周血CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞的比例。由此可見，脾臟在慢性應(yīng)激促腫瘤進(jìn)展過程中起促進(jìn)作用，慢性應(yīng)激增加外周血CD11b+Ly6C+CCR2+單核細(xì)胞可能來源于脾臟。