張 寧，秦錫靜，張志強 ，張敬坤，黃向華*，朱玉林

(1.河北省石家莊市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，河北 石家莊 050011；2.湖南省常德市湘雅常德醫(yī)院婦產科，湖南 常德 415000；3.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050000)

正常陰道缺失是由先天性陰道發(fā)育不良(Mayer-Rokitansky-Küstner-Hauser,MRKH綜合征)或獲得性疾病(例如癌癥和創(chuàng)傷)引起的。為了滿足這些患者生理及心理的需求通常需要陰道重建。重建一個最接近正常陰道形態(tài)和功能的陰道是醫(yī)者遵循的原則和目標[1]。陰道重建的方法主要包括非手術的頂壓法和手術治療。非手術治療曾被認為是先天性無陰道患者的一線治療，但這種方法能否成功的關鍵在于患者會陰局部的條件及患者的依從性，需要較長時間的治療才能達到足夠的長度，治療過程中可能給患者增加較多的心理負擔。手術治療能在短期內達到治療效果也減少了患者的心理負擔，因此成為目前常用的治療方法。目前陰道重建最常用的方法是在膀胱和直腸之間造穴再以腹膜，皮瓣，腸管或羊膜等組織重建陰道[2-3]。但是，這些方法均不能很好的重建陰道，使用自體組織會給患者帶來不必要的損傷和并發(fā)癥，異體組織又可能導致排斥反應及感染外源性疾病。近年來隨著組織工程技術的發(fā)展[4]，各種新型支架材料被應用于陰道重建，如脫細胞真皮基質[5]，防粘連膜[6]，脫細胞小腸黏膜下基質[7]等，給陰道重建患者帶來了新的希望，但是何種材料更優(yōu)，各種材料的比較和選擇又給科研工作者及臨床醫(yī)生提出了新的挑戰(zhàn)。陰道重建動物模型的構建就顯得尤為重要。本研究用小腸黏膜下基質(small intestinal submucosa，SIS)作襯里構建大鼠陰道重建動物模型，探討其可能性，并通過檢測相關指標研究重建效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 雌性Sprague-Dawley大鼠[河北省實驗動物中心，實驗動物質量合格證號1403076。許可證號：SCXY(冀)2013-1-003]。免疫組織化學試劑盒(北京中杉生物技術有限公司)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(Abgent)，廣譜細胞角蛋白(AE1/AE3)單克隆抗體。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠陰道重建動物模型的構建 選擇體重200～250 g的成年雌性Sprague-Dawley大鼠用于陰道重建。1%戊巴比妥鈉(30～50 mg/kg)腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥位固定于手術臺上，局部備皮消毒。在陰道黏膜下注入腎上腺素生理鹽水形成水墊，從陰道黏膜和會陰皮膚交界處剪開，牽拉陰道黏膜將陰道黏膜從陰道口向上分離至陰道穹窿處，切除整個陰道，術中避免尿道和直腸的損傷。將生理鹽水預濕的SIS(前期實驗制備[8])包裹于模具上并縫合連接處(橡膠管自制管型陰道模具，長度為13 mm，外徑為4 mm，膠管上剪數個菱形小孔，使模具既有支撐作用又減少對局部組織的壓迫)，置入原陰道處，上端固定于宮頸處，下端縫合于陰道外口。術后大鼠分籠喂養(yǎng)，術后3 d內腹腔注射抗生素預防感染。

1.2.2標本收集及免疫組織化學檢測 分別于術后14 d、1個月、3個月隨機處死6只大鼠，取出陰道全層進行檢測，HE染色，免疫組織化學SP法檢測重建陰道組織中角蛋白(AE1/AE3 1∶100)，α平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA 1∶800)及神經纖維標記物-蛋白基因產物(PGP9.5 1∶400)的表達。4只大鼠于12周處死用于組織浴槽檢測。

1.2.3陰道組織的功能檢測 將6只正常大鼠及4只實驗組大鼠處死后取出整個陰道組織，橫行切取陰道遠端組織，使切下的組織為寬1～2 mm的環(huán)狀。將環(huán)狀組織連接到組織浴槽的張力傳感器上，浸入含有Krebs溶液的浴槽中(實驗前Krebs溶液用95%O2和5%CO2的混合氣體平衡20～30 min，整個實驗過程中持續(xù)通氣并使液體溫度維持在37 ℃)。組織固定好后調節(jié)預負荷至0.5 g并使其平衡60 min。實驗前用高鉀溶液(124 mmol/L)評估陰道組織的活性，有活性的組織分別給予30 Hz，60 Hz及90 Hz的電場刺激，電壓均為30 V，均持續(xù)0.5 s，觀察陰道組織的張力變化情況。整個實驗控制在取材后6 h之內，實驗過程中每15～20 min更換一次Krebs溶液以保證組織的活性。

2 結 果

2.1重建陰道的組織學檢測

2.1.1重建陰道巨檢 重建陰道14 d時，質地比較韌，沒有彈性，隨時間延長質地逐漸變軟，至3個月時明顯變軟，并且有一定的彈性(圖1)。

2.1.2重建陰道的免疫組織化學結果

2.1.2.1HE染色及AE1/AE3染色觀察 14 d時HE染色可見有部分上皮樣組織從陰道入口向上爬行，AE1/AE3染色陽性，伴有較多炎細胞浸潤，1個月時上皮組織能覆蓋整個陰道，3個月時上皮組織更加成熟，基底層可見釘狀突起(箭頭所示)，局部可見角化上皮組織，僅有少量炎細胞浸潤，與正常陰道組織大致相同(圖2)。

2.1.2.2α-SMA染色觀察 1個月時重建陰道組織中有少量組織表達α-SMA，提示有平滑肌的再生，3個月時α-SMA表達增多局部形成束狀，但是再生的平滑肌連續(xù)性欠佳，與正常陰道平滑肌差距明顯(圖3)。

2.1.2.3PGP 9.5染色觀察 直到術后3個月重建陰道組中才偶見PGP9.5陽性的神經組織(圖4)。

2.2重建陰道的功能學檢測 正常陰道組織在頻率為30，60，90 Hz的電場刺激下收縮強度逐漸增大。重建陰道3個月時在頻率為30，60，90 Hz的電場刺激下有微弱的反應，隨頻率增加收縮強度稍增強，但其收縮強度明顯小于正常陰道(圖5)。

3 討 論

陰道重建是滿足無陰道患者生理及心理需求的有效手段。近年來隨著組織工程的發(fā)展，各種新型材料的應用，給無陰道患者帶來了新的希望。構建陰道重建動物模型篩選最佳材料重建陰道就成為亟待解決的問題。

用于陰道重建的實驗動物有綿羊、中國小型實驗豬、兔子、大鼠和小鼠[9-10]。綿羊和中國小型實驗豬體型較大，適于有初步研究結果后的進一步研究，不適用于初期實驗，小鼠由于其體型太小不利于手術操作及術后護理。大鼠體型適中，其陰道較寬且易與周圍組織分離，便于手術操作及術后護理，更適合于初期實驗。雖然Zhang等[10]亦用大鼠進行了陰道重建，但他們是部分陰道切除后的重建，不能很好的模擬臨床上先天性無陰道患者。課題組前期研究進行了一些初步的嘗試[11]，能夠順利完成手術，但術后陰道模具脫落及閉鎖率較高，僅觀察到術后1個月，本研究進一步改善手術操作，陰道模具及術后護理，使術后陰道模具脫落及閉鎖率明顯降低，還進一步完善了重建陰道的相關檢測，尤其是組織浴槽對陰道功能的檢測，為支架材料的篩選奠定良好的基礎。

上皮組織是最先再生的組織。本研究發(fā)現大鼠重建陰道14 d時可見有部分上皮組織從陰道入口向上爬行，1個月時上皮組織能覆蓋整個陰道，3個月時上皮組織進一步成熟。平滑肌的再生較慢，術后3個月時才有少量肌束形成，有研究發(fā)現平滑肌的再生可能是由成纖維細胞及來自循環(huán)中的干細胞分化而成，或是由周圍正常組織中的平滑肌細胞及其祖細胞遷移而來[12]。神經組織再生最慢，術后3個月重建陰道組中才偶見PGP9.5陽性的神經組織。

陰道的收縮性決定了陰道的功能，其收縮的組織學基礎就是陰道平滑肌。大鼠陰道平滑肌內層呈環(huán)行分布，外層呈縱行分布，陰道近端平滑肌層較薄，而遠端平滑肌層厚度增加，至陰道口水平，環(huán)行平滑肌明顯增厚形成括約肌樣結構。人們使用組織浴槽的方法研究了子宮平滑肌[13]，腸道平滑肌[14]，氣管平滑肌[15]等各種平滑肌的功能，但迄今為止，關于陰道功能的研究很少，僅少數學者用組織浴槽的方法研究了各種藥物對糖尿病動物模型和卵巢切除術后陰道組織收縮功能及強度變化的影響和內源性的肽類對人類陰道組織功能的影響。基礎研究發(fā)現，大鼠陰道近端的橫向組織環(huán)和縱向組織條，僅對高鉀溶液(K+124 mmol/L)有微弱的反應，而對EFS沒有反應或反應微弱。只有陰道遠端的橫向組織環(huán)顯示出可重復的收縮反應，這些組織環(huán)被用于進一步研究。因此，選用了陰道遠端的橫向組織環(huán)來評估重建陰道的功能。

實驗前首先要驗證組織的活性，用高鉀溶液(K+124 mmol/L)檢測陰道組織的收縮情況，組織有收縮反應說明活性好，可以應用于后續(xù)實驗。預實驗發(fā)現在電場刺激的其他條件不變電壓從5 V增加到100 V時(間隔5 V)，陰道的收縮強度僅輕度增加，在20～30 V時達到峰值，收縮強度變化不明顯；其他條件不變頻率從10 Hz增加到100 Hz(間隔為10 Hz)，陰道的收縮強度逐漸增加，在80～90 Hz時達到峰值，收縮強度變化明顯；其他條件不變持續(xù)時間的變化主要影響收縮波波峰的寬度，收縮強度變化不明顯?？傊?，電場刺激的頻率變化對陰道收縮強度的影響最大，因此將電壓固定30 V，持續(xù)時間固定在0.5 s，選擇頻率為30，60和90 Hz的電場刺激來評估陰道的功能。正常陰道組織在頻率為30，60和90 Hz的電場刺激下，收縮強度逐漸增強。重建陰道在頻率為30 Hz的電場刺激下僅有微弱的反應，隨頻率增加收縮強度稍增強，與正常陰道組織有類似的變化趨勢，但收縮強度差距明顯。

大鼠陰道重建模型可以從組織學及功能學上評估重建陰道的功能，便于各種支架材料間的比較。但是單純應用支架材料構建陰道仍不能達到理想的效果，組織工程除了有支架組織外還應該復合合適的種子細胞，近年研究發(fā)現復合種子細胞后能加速組織的修復與再生[16]。選擇合適的種子細胞加速平滑肌的再生，促進陰道功能的恢復將是進一步研究的重點。

總之，本研究成功構建了大鼠陰道重建模型，并應用免疫組織化學及組織浴槽對重建陰道進行了組織學及功能學研究。借助大鼠陰道重建模型可以評估多種支架材料的用于陰道重建的效果，為進一步構建更好的重建陰道奠定了基礎。(本文圖見封三)