劉娜，姜麗波，張淑英，周虹，曲延章，姚宇寧，許玲玲，周暢

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院血液科，黑龍江齊齊哈爾161000

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種骨髓造血衰竭綜合征，以骨髓造血細(xì)胞增生減低和外周血全血細(xì)胞減少為特征，在臨床上表現(xiàn)為不同程度的三系血細(xì)胞減少所致的貧血、出血和感染等[1-2]。有關(guān)AA的“免疫介導(dǎo)”發(fā)病機(jī)制,國(guó)內(nèi)外均認(rèn)為細(xì)胞免疫異常在其發(fā)病中起重要作用[3]，因此AA實(shí)質(zhì)上是以骨髓組織為靶器官的T細(xì)胞免疫異常介導(dǎo)的疾病[4-5]。早期研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (regulatory T cell，Tregs）持續(xù)表達(dá)在機(jī)體免疫抑制反應(yīng)和免疫耐受狀態(tài)方面起重要作用[6-7]。Foxp3是轉(zhuǎn)錄因子叉頭樣/翼狀螺旋家族成員，是Treg最具有特征性的分子標(biāo)志，對(duì)Treg細(xì)胞發(fā)育成熟和功能完善發(fā)揮重要作用，同時(shí)在維持免疫耐受中起重要作用[8-9]。因此，目前關(guān)于Treg細(xì)胞在AA診斷方面的研究報(bào)道很多[10-13]，但是，針對(duì)Treg細(xì)胞在不同亞群AA之間的分布及差異的報(bào)道還不是很多。因此，該研究主要探討2017年1月—2019年1月期間初診的急性再生障礙性貧血（SAA）和慢性再生障礙性貧血（CAA)共40例患者外周血中CD4+、CD25+和Foxp3+Treg細(xì)胞亞群變化情況及相關(guān)基因表達(dá)情況，評(píng)價(jià)其在AA診斷中的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取該院血液科收治的初發(fā)AA患者40例，平均年齡（55.42±22.7）歲；男性17例，女性23例。根據(jù)《中國(guó)再生障礙性貧血的診斷和治療專(zhuān)家共識(shí)》(2017)診斷及分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)將患者分為CAA患者18例，男8例，女10例。SAA患者22例，男9例，女13例。同時(shí)選擇健康體檢20名正常人作為對(duì)照組（CN），平均年齡為（58.36±17.2）歲；男8名，女12名。3組一般資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。所有患者知情同意該次研究。

1.2 方法

所有受試者均清晨空腹收集血樣。所有樣本被放置在正?？瞻撞裳軆?nèi)4℃條件下儲(chǔ)存2～3 h,然后3 000 r/min離心20 min。收集血清樣本，并在-80℃冷凍后進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。該研究所有受試者均簽署知情同意書(shū)并由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 主要試劑及儀器

熒光標(biāo)記的抗體：Anti-Human Foxp3 Staining Kit-Alexa Fluor 647,Foxp3(259D/C7),CD4(RPA-T4),CD25(M-A251)，Human Foxp3 Buffer set（BD bioscience公司，USA）；BD FACSCanto II型流式細(xì)胞儀(BD公司，USA)；Hitachi 7600自動(dòng)臨床生化分析儀(Hitachi公司,日本)。PE標(biāo)記的抗人CD4、PE-Cy5標(biāo)記的抗人CD25及FITC標(biāo)記的抗人Foxp3試劑盒(含配套的固定和透膜試劑)均購(gòu)自EB ioscience公司；淋巴細(xì)胞分離液(上海哈靈生物科技有限公司，中國(guó))；RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒(Takara)。Nano Drop 2000分光光度計(jì)(Nano Drop Technologies,USA)。Stratagene MX4000TM熒光定量PCR儀（Agilent Technologies,USA）。

1.4 方法

將-80℃凍存的外周血清置于4℃下凍緩后取2 mL加入EDTA抗凝管，充分混勻；準(zhǔn)備兩根流式管，標(biāo)明同型對(duì)照管和檢測(cè)管，分別用1、2表示；取外周血清100μL分別加入兩管，兩管內(nèi)均加入C D4-FITC/CD25-BC96各20μL，暗室室溫避光孵育30 min后加入稀釋的溶血素和破膜劑，反應(yīng)后以破膜緩沖液洗滌并重懸，1號(hào)管加入I gG-PE 5μL，2號(hào)管加入Foxp3-PE 20μL，再次暗室室溫避光孵育30 min；加入5 mL PBS緩沖液沖洗，1 200 r/min離心5 min去上清。加入400μL PBS緩沖液上機(jī)檢測(cè)。

1.5 FCM檢測(cè)

采用BD公司的FACSCantoII型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果分析用Cellquest軟件。在FSC-SSC點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群,然后分析該群細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞內(nèi)CD4+細(xì)胞的表達(dá)情況。以CD4+和SSC設(shè)門(mén),選擇CD4+細(xì)胞分析其中CD25+和Foxp3表達(dá),并按CD25+表達(dá)程度的不同設(shè)門(mén)進(jìn)行分析其中Foxp3細(xì)胞所占比例。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)

采用Trizol法常規(guī)提取細(xì)胞總RNA共10 uL,將提取得到的總RNA使用NanoDrop2000分光光度計(jì)（Nano Drop Technologies USA）檢測(cè)濃度，分別取各樣品RNA 500 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA（Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）。采 用Ace Q qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme）試劑盒在Stratagene MX4000TM（Agilent Technologies）熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5 min，40個(gè)循環(huán)的95°C 10 s和60°C 30 s，最后是95°C 15 s、60°C 1 min和95°C 15 s來(lái)獲得溶解曲線(xiàn)。所檢測(cè)的各基因及β–ACTIN內(nèi)參的引 物 為CD4-F：ATTG GGCTAGGCATCTTCTT；CD4-R：GGACACTGGCAGGTCTTCTT，CD25-F：AAGGTGCAAAT CAATGCGTAC；CD25-R：CCTCCAT CCCTTCTCCCTCT，F(xiàn)oxp3-F：TTTCTGTCAGTCCACTTCACCA；Foxp3-R：CCAGCAGGTCTGAGGCT TTG，β-ACTIN-F：TGGCACC CAGCACAATGAA；β-ACTIN-R：TAAGTCATAGTCCGCCTAGA AGCA。熒光定量PCR獲得的各基因CT值用于計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為：相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。分別測(cè)出CD4+、CD25+和Foxp3的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血中CD4+,CD4+CD25+和Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)水平

SAA及CAA患者外周血中CD4+,CD4+CD25+和Foxp3 Treg細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)，可以看出對(duì)于CN組，SAA及CAA患者患者Treg細(xì)胞比率顯著減少，見(jiàn)圖1；另通過(guò)Cellquest軟件計(jì)算不同細(xì)胞系的細(xì)胞占比，相對(duì)于CN組，CAA組及SAA組外周血中的上述指標(biāo)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這說(shuō)明AA患者的外周血中CD4+細(xì)胞以及Foxp3 Treg細(xì)胞的表達(dá)均顯著下降；另外，CAA及SAA組之間進(jìn)行比較時(shí)也能看出類(lèi)似的趨勢(shì)，CAA組的Foxp3 Treg細(xì)胞檢測(cè)值為（2.64±0.48）%，明顯高于SAA組的（1.51±0.34）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)對(duì)比CAA組的CD4+以及CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)比率均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組研究對(duì)象外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及Foxp3的表達(dá)水平[（±s），%]

表1 3組研究對(duì)象外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及Foxp3的表達(dá)水平[（±s），%]

注：與對(duì)照組之間比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CAA組之間比較，ΔP＜0.05

組別CD3+CD4+/CD3+CD3+CD4+CD25+/CD3+CD4+CD3+CD4+CD25+Foxp3+/CD3+CD4+CAA組SAA組CN組（33.36±13.87）*（31.61±13.27）**Δ（16.14±4.06）*（13.72±6.63）**Δ（2.64±0.48）**（1.51±0.34）**Δ 52.05±9.42 23.97±5.93 5.05±1.38

圖1 外周血中表達(dá)CD4+,CD25+和Foxp3 T淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

2.2 外周血中CD4+,CD4+CD25+和Foxp3 Treg細(xì)胞mRNA表達(dá)情況

SAA及CAA患者外周血中CD4+,CD4+CD25+和Foxp3 Treg細(xì)胞的mRNA表達(dá)情況，見(jiàn)圖2。可以看出與CN組比較，SAA及CAA患者的Treg細(xì)胞mRNA表達(dá)顯著減少；但與流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果不同的是，在CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平CAA組（0.77±0.28)和SAA組（0.63±0.09）之間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，SAA組與CAA組及CN組比較Foxp3 mRAN表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組研究對(duì)象外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及Foxp3 mRNA表達(dá)情況（±s）

表2 3組研究對(duì)象外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及Foxp3 mRNA表達(dá)情況（±s）

注:與對(duì)照組之間比較*P＜0.05，**P＜0.01;與CAA組之間比較：ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01

組別CD4+CD4+CD25+ CD4+CD25+Foxp3+CAA組SAA組CN組（0.83±0.32）**（0.55±0.37）**ΔΔ（0.77±0.28）**（0.63±0.09）**Δ（0.63±0.19）**（0.43±0.11）**ΔΔ 1.03±0.43 1.07±0.17 0.96±0.28

圖2 3組外周血中CD4+、CD4+CD25+和CD4+CD25+Foxp3+mRNA定量PCR檢測(cè)表達(dá)情況

3 討論

正常人外周血中的全血T淋巴細(xì)胞主要包括T輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞亞群（CD4+）和T抑制/細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞亞群（CD8+），其中CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞在輔助B淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫等方面發(fā)揮著重要作用[14-15]。目前已經(jīng)有足夠的證據(jù)證實(shí)AA發(fā)病過(guò)程中存在Th淋巴細(xì)胞亞群異常[16]，這其中以CD4+T細(xì)胞進(jìn)入骨髓后能夠分泌大量細(xì)胞因子并對(duì)骨髓干細(xì)胞起到破壞作用，是導(dǎo)致骨髓衰竭的主要環(huán)節(jié)[17]。在該研究中，發(fā)現(xiàn)SAA組及CAA組外周血中CD3+CD4+/CD3+比值較健康人顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明AA患者外周血中CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞減少。早期研究[18]發(fā)現(xiàn)AA患者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞減少的同時(shí)，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，導(dǎo)致Th細(xì)胞的不同亞群之間的平衡被打破，導(dǎo)致細(xì)胞功能亢進(jìn)，進(jìn)而也可以抑制造血干細(xì)胞的功能，這也是導(dǎo)致骨髓衰竭的原因，因此，這些外周血中T細(xì)胞亞群的變化最終會(huì)引起患者造血功能障礙的臨床表現(xiàn)。再生障礙性貧血患者不僅具有異常的T細(xì)胞數(shù)量，而且在T細(xì)胞的分布，表型和功能方面也有顯著變化。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是在未活化的CD4+T細(xì)胞中新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制性和免疫無(wú)能性。石秀珍等人[19]通過(guò)對(duì)46例AA患者與正常對(duì)照組比較，AA組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞明顯降低（t=2.738，P＜0.01），且SAA組低于CAA組（t=1.986，P＜0.01）。同時(shí)進(jìn)行CD4+CD25+Treg和T細(xì)胞亞群免疫狀態(tài)檢測(cè)，陽(yáng)性率分別為71.7%和60.9%，得出前者免疫狀態(tài)異常的敏感性高于后者（χ2＝4.290，P＜0.05)。僅依靠T細(xì)胞亞群來(lái)反應(yīng)AA患者的免疫紊亂尚不全面和準(zhǔn)確。在監(jiān)測(cè)AA患者免疫功能異常、評(píng)估病情及免疫抑制劑療效時(shí)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞優(yōu)于經(jīng)典T細(xì)胞亞群。該研究的實(shí)驗(yàn)顯示AA患者CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)比率均明顯低于CN組(P＜0.05)，且SAA組（13.72±6.63）%低于CAA組（16.14±4.06）%（P＜0.05），同石秀珍等[19]研究結(jié)果。AA患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量減 少 和 或 其 遷移功能、免疫抑制功能等受損，免疫抑制和免疫監(jiān)視作用減弱，導(dǎo)致自身效應(yīng)性T細(xì)胞過(guò)度活化增殖或不能抑制效應(yīng)性T細(xì)胞功能[20]。Foxp3是Treg最具有特征性的分子標(biāo)志，在AA的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。該研究中Foxp3 mRAN檢測(cè)與流式細(xì)胞中Foxp3表達(dá)比率檢測(cè)的結(jié)果相一致，均為SAA組與CAA組和CN組比較表達(dá)下降，且SAA組低于CAA組。與流式細(xì)胞檢測(cè)中不一致的是下降差異更明顯(P＜0.01)。表明Foxp3 Treg細(xì)胞在AA患者中作為檢測(cè)指標(biāo)更敏感，且疾病嚴(yán)重程度導(dǎo)致了更低的Foxp3Treg細(xì)胞檢測(cè)數(shù)值。該研究的結(jié)果說(shuō)明AA患者T細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞受損，SAA患者比CAA患者受損程度嚴(yán)重。這與徐金格等[21]研究顯示AA患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及Foxp3在CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)百分比明顯比正常人降低的結(jié)果相同。因此，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率能夠作為一項(xiàng)指標(biāo)來(lái)評(píng)估AA的嚴(yán)重程度。

Treg細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞間接觸途徑殺傷細(xì)胞毒性細(xì)胞，抑制細(xì)胞毒性細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2（IL-2）等細(xì)胞因子，以及分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）這3種途徑發(fā)揮免疫耐受和免疫抑制作用[22]，當(dāng)Treg細(xì)胞疫抑制功能降低時(shí)，對(duì)自身免疫性T細(xì)胞活化增殖的抑制能力降低，異常激活效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，發(fā)生自身免疫應(yīng)答，影響造血細(xì)胞的生成，導(dǎo)致骨髓造血功能衰竭[23]。另外，Zou L等[24]發(fā)現(xiàn)骨髓是Treg細(xì)胞重要的儲(chǔ)存池，Treg通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α/趨化因子受體CXCR4通路即SDF-1α/CXCR4信號(hào)通路遷徙至骨髓，從而發(fā)揮Treg細(xì)胞調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞的機(jī)制。因此當(dāng)AA患者的骨髓功能減退時(shí)，會(huì)間接導(dǎo)致Treg細(xì)胞功能障礙，進(jìn)一步誘導(dǎo)并加重T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，加重AA患者的骨髓衰竭癥狀。在該研究中，發(fā)現(xiàn)SAA患者與CAA患者比較外周血中Treg細(xì)胞比值顯著減少,且SAA患者的Treg細(xì)胞減少的程度要重于CAA，這說(shuō)明在AA患者體內(nèi)Treg細(xì)胞受損情況明顯，且可反應(yīng)疾病的嚴(yán)重程度；另外，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示相應(yīng)的Foxp3 mRNA基因表達(dá)與流式細(xì)胞結(jié)果得到類(lèi)似趨勢(shì)，也能夠證實(shí)這一結(jié)果。

綜上所述。盡管該研究還存在入選病例不足，但是該研究結(jié)顯示AA患者外周血中CD4+CD25+和CD4+CD25+Foxp3+顯著下降的結(jié)果說(shuō)明了AA患者在發(fā)病過(guò)程中存在明確的Th淋巴細(xì)胞亞群異常，Treg調(diào)節(jié)T細(xì)胞系統(tǒng)受損。而SAA組的Treg細(xì)胞低于CAA組說(shuō)明Treg細(xì)胞下降能夠作為指標(biāo)來(lái)幫助評(píng)估臨床疾病的嚴(yán)重程度。