劉入華，李篤軍，李宜雷，劉艷飛，董丹丹，朱元祺*

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島266003；2.山東省煙臺業(yè)達醫(yī)院，山東 煙臺264006；3.山東省日照市人民醫(yī)院，山東 日照276826；4.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島266071)

奇異變形桿菌常常分布于人和動物的腸道內(nèi)，是臨床上重要的條件致病菌，可引起人的泌尿道、血流、傷口和呼吸道感染[1-2]。近十幾年來，由于抗菌藥物的不合理使用，奇異變形桿菌呈現(xiàn)多重耐藥增加的趨勢，甚至分離出對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的臨床株[3-4]。另外，由于奇異變形桿菌對替加環(huán)素和多粘菌素天然耐藥，一旦分離株對碳青霉烯類耐藥，對奇異變形桿菌引起的感染將面臨無藥可用的局面。目前為止，對于奇異變形桿菌耐藥機制的有關(guān)報道以產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和頭孢菌素酶(質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的AmpC酶)多見，而對碳青霉烯酶的報道不多。因此，本研究對2019年8月-2019年9月分離自ICU患者的5株耐碳青霉烯類奇異變形桿菌的耐藥機制和同源性進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床和質(zhì)控菌株5株耐碳青霉烯類奇異變形桿菌(HFK665-669)臨床株于2019年8月-2019年9月分離自ICU患者的尿液或痰液標(biāo)本。藥敏質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853和脈沖場電泳分子量標(biāo)記沙門菌H9812都為本實驗室保存。

1.2 主要設(shè)備與試劑法國生物梅里埃VITEK-2 Compact進行菌株的鑒定和藥敏，藥物敏感性的判定依據(jù)CLSI-2019標(biāo)準(zhǔn)[5]。擴增儀、脈沖場電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)為美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品。DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)、瓊脂糖和PCR擴增試劑為大連寶生生物生產(chǎn)。

1.3 編碼碳青霉烯酶耐藥基因的擴增和測序擴增編碼碳青霉烯酶耐藥基因(blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48和blaVIM)依據(jù)參考文獻進行[6]。耐藥基因的PCR引物合成和擴增產(chǎn)物的測序由生工(上海)生物工程有限公司完成。

1.4 菌株的Xba I脈沖場凝膠電泳(PFGE)和S1核酸脈沖場凝膠電泳(S1-PFGE)具體操作參照文獻改良[2]。電泳條件：轉(zhuǎn)換時間6.8 s-35.4 s，轉(zhuǎn)角120，電泳時間18.5 h。

1.5 菌株的全基因組測序基于Illumina Miseq和Nanopore MinION測序平臺對奇異變形桿菌(HFK665-669)臨床株進行測序。然后，利用ResFinder、Tn Number Registry和INTEGRAL等軟件分析菌株的生物信息，并使用Inkscape0.48.1軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株的的藥敏和β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因

5株奇異變形桿菌(HFK665-669)臨床株耐藥表型一致，顯示對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢替坦、厄他培南、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶哌耐藥或中介，但對氨曲南敏感。PCR擴增顯示這5株臨床菌blaNDM基因陽性，經(jīng)測序比對確認(rèn)為blaNDM-1型。另外，高通量測序也顯示,這5株菌除了攜帶blaNDM-1外，還攜帶blaTEM-1、blaCMY-2和blaOXA-1型β-內(nèi)酰胺酶基因。結(jié)果見表1、表2和圖1。

表1 奇異變形桿菌臨床株的藥敏結(jié)果(μg/mL)

2.2 菌株的Xba I脈沖場凝膠電泳和S1核酸脈沖場凝膠電泳

Xba I脈沖場凝膠電泳結(jié)果顯示這5株奇異變形桿菌在條帶數(shù)目、位置分布上基本相同，條帶相差在3條以內(nèi)，依據(jù)Tenover規(guī)則[7]和菌株分離的時間及科室，可以判定這5株耐碳青霉烯類奇異變形桿菌(HFK665-669)之間有同源性，而且表明在ICU患者間存在克隆的流行播散。另外，S1核酸脈沖場凝膠電泳未顯示質(zhì)粒條帶，進一步驗證耐藥基因在染色體上。脈沖場凝膠電泳結(jié)果見圖2。

表2 奇異變形桿菌臨床株攜帶的β-內(nèi)酰胺酶基因

圖1 PCR擴增blaNDM-1基因的產(chǎn)物電泳圖

2.3 菌株的全基因組測序結(jié)果

經(jīng)軟件分析奇異變形桿菌高通量測序數(shù)據(jù)，生物信息結(jié)果顯示染色體上NDM相關(guān)區(qū)域攜帶耐藥基因的移動元件包括：轉(zhuǎn)座子ΔTn2、轉(zhuǎn)座子ΔTn125和整合子 In27。ΔTn2由ΔtnpA-res-tnpR-blaTEM-1-IRR片段構(gòu)成；ΔTn125由ΔISAba125、ΔblaNDM-1、bleMBL和ΔtrpF組成；整合子In27屬于反方向的復(fù)合型Ⅰ型整合子，結(jié)構(gòu)為 IRi、5’保守片段、可變區(qū) 1(dfrA12-gcuF-aadA2)、3’保守片段的第1個拷貝、ISCR1、可變區(qū) 2(ΔcatB3-arr3)、3’保守片段的第2個拷貝(qacED1-Δsul1)。NDM相關(guān)區(qū)域與參考移動元件的比較結(jié)果見圖3。

圖2 Xba I酶切奇異變形桿菌基因組脈沖場凝膠電泳

圖3 變形桿菌(HFK665-669)的blaNDM-1基因區(qū)域與參考移動元件的比較

3 討論

隨著抗菌藥物的不合理使用，奇異變形桿菌對β-內(nèi)酰胺抗生素的耐藥性逐年升高，其耐藥機制主要與產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)，包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、AmpC酶和碳青霉烯酶等[3]。

自2008 年美國Tibbetts等研究人員[4]首次報道攜帶blaKPC-2基因的奇異變形桿菌臨床株后，不同國家和地區(qū)又陸續(xù)報道了產(chǎn)不同型碳青霉烯酶的奇異變形桿菌。如巴西、意大利、奧地利和法國又陸續(xù)報道了產(chǎn)KPC-2、IMP-1、NDM-1、NDM-5和OXA-23型碳青霉烯酶的奇異變形桿菌[8-12]。這些編碼碳青霉烯酶耐藥基因既可位于質(zhì)粒上，也可以整合到菌株的染色體上[13-14]。本研究顯示：這5株奇異變形桿菌(HFK665-669)臨床株耐藥表型一致，除了對氨曲南敏感外，對測試的抗菌藥物都耐藥或中介。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序和高通量測序都證明這五株菌攜帶blaNDM-1基因，而且該基因位于染色體上。

另外，對本研究的奇異變形桿菌HFK665的生物信息進行分析，結(jié)果顯示染色體上NDM相關(guān)區(qū)域攜帶耐藥基因的移動元件包含轉(zhuǎn)座子ΔTn2、轉(zhuǎn)座子ΔTn125和整合子 In27。Tn2屬于 Tn3家族的轉(zhuǎn)座子，結(jié)構(gòu)為 IRL(左向反向重復(fù)序列)、tnpA(轉(zhuǎn)座酶)、res(解離位點)、tnpR(解離酶)、blaTEM-1(β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因)和IRR(右向反向重復(fù)序列)，并且以5 bp的直接重復(fù)序列(DRs：轉(zhuǎn)座復(fù)制信號)為界。但是，在HFK556的染色體上NDM相關(guān)區(qū)域，ΔTn2由ΔtnpA-res-tnpR-blaTEM-1-IRR片段構(gòu)成。Tn125最初在不動桿菌屬菌株的質(zhì)粒pNDM-BJ01中發(fā)現(xiàn)，包括以下結(jié)構(gòu)：ISAba125、blaNDM-1、bleMBL、trpF、dsbD、cutA、groES、groEL和ISCR21，并且被3 bp的DRs 所包圍[15]。Tn125經(jīng)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)座方式移動并且在復(fù)雜重組過程中以各種截短的形式存在。相比于完整的Tn125，在HFK556的染色體上NDM相關(guān)區(qū)域的ΔTn125由ΔISAba125、ΔblaNDM-1、bleMBL和ΔtrpF組成。并且它位于整合子In27的ISCR1的上游，這可能與ISCR1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移有關(guān)。復(fù)合型I型整合子包括IRi、5’保守片段(IntI1-attI1：整合酶-整合位點)、可變區(qū) 1(variable region 1：VR1)、3’保守片段的第1個拷貝(3’-CS1：qacED1-sul1))、ISCR1、可變區(qū) 2(variable region 2 ：VR2)、 3’保守片段的第2個拷貝(3’-CS2：qacED1-sul1-orf5-orf6)、Tn402的tni模塊和 IRt結(jié)構(gòu)，并被5bp 的 DRs 所包圍。整合子In27屬于反方向的復(fù)合型 1 型整合子，結(jié)構(gòu)為 IRi、5’保守片段、可變區(qū) 1(dfrA12-gcuF-aadA2)、3’保守片段的第1個拷貝、ISCR1、可變區(qū) 2(ΔcatB3-arr3)、3’保守片段的第2個拷貝(qacED1-Δsul1)。

AmpC酶包括質(zhì)粒和染色體介導(dǎo)兩種形式，其中blaCMY屬于染色體介導(dǎo)的耐藥基因，主要水解青霉素等抗菌藥物[3]。本研究還顯示，除了攜帶blaNDM-1基因外，奇異變形桿菌HFK665還攜帶blaTEM-1、blaCMY-2和blaOXA-1型β-內(nèi)酰胺酶基因，這與國內(nèi)外關(guān)于奇異變形桿菌中的AmpC酶基因以blaCMY型為主的報道相一致[16]。

目前，耐碳青霉烯類奇異變形桿菌的克隆聚集流行案例報道以攜帶blaKPC-2基因為主，且該基因既可位于質(zhì)粒上，也可位于染色體上[3,4,16]。本研究中的5株奇異變形桿菌分離于尿液和痰液，依據(jù)Tenover規(guī)則，Xba I脈沖場凝膠電泳結(jié)果表明這些菌(HFK665-669)之間存在有同源性，即在ICU患者間存在克隆的流行播散。經(jīng)檢索，染色體上攜帶blaNDM-1、blaTEM-1、blaCMY-2和blaOXA-1基因的奇異變形桿菌的克隆傳播屬于國內(nèi)外首次報道。另外，有學(xué)者報道了從動物、家禽肉制品分離到多重耐藥或耐碳青酶烯類奇異變形桿菌，這提示耐藥株可能在人和動物之間傳播[4,17]。因此，對于預(yù)防耐碳青霉烯類奇異變形桿菌的流行，涵蓋了許多環(huán)節(jié)，尤其要重視醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)部的醫(yī)院感染控制，以預(yù)防其流行和暴發(fā)。