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        熱休克蛋白90對結(jié)腸癌荷瘤小鼠肝臟功能的影響

        2021-05-25 10:41:52李佳昕馬嬌艷
        中國實驗診斷學 2021年5期
        關(guān)鍵詞:線粒體乙醇試劑盒

        于 爽,吳 穎,李佳昕,齊 航,馬嬌艷,林 楠

        (1.錦州市中心醫(yī)院 消化科,遼寧 錦州121000;2.吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 病理生理學教研室,吉林 長春130021)

        熱休克蛋白90(HSP90)作為細胞內(nèi)關(guān)鍵的伴侶分子,能夠?qū)Χ喾N客戶蛋白的穩(wěn)定性和功能發(fā)揮調(diào)控作用,這些客戶蛋白直接參與調(diào)節(jié)細胞生長和存活[1-3]。在腫瘤細胞中多種HSP90客戶蛋白發(fā)生突變或者過表達,因此,抑制HSP90能夠同時降解多個客戶蛋白為腫瘤的治療提供了新途徑[4-5]。線粒體是細胞的能量工廠,為細胞的生存提供了最基本的能量供應[6]。肝臟作為機體內(nèi)藥物代謝的主要場所,需要大量的能量維持其基本功能,因此維持肝細胞內(nèi)線粒體功能的穩(wěn)定是避免肝細胞損傷的重要靶點[7]。有研究發(fā)現(xiàn),HSP90能夠協(xié)助線粒體蛋白進入線粒體,進而調(diào)控線粒體功能[8]。但是,HSP90抑制劑作為新興的抗腫瘤藥對肝臟組織作用尚不明確。因此,本研究以結(jié)腸癌荷瘤小鼠為基礎(chǔ),分析HSP90在結(jié)腸癌介導肝臟損傷中的作用。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1實驗動物分組及給藥 健康的SPF級BALB/C雄性6-8周齡小鼠20只購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(吉)-2020-0002],進行隨機分組,分為對照組和PU-H71組,每組各10只。將5×106結(jié)腸癌CT-26細胞(購自中國科學院上海細胞庫)接種至小鼠右后腿外側(cè)。待腫瘤直徑到3 mm時,經(jīng)尾靜脈給藥,按2 mg/kg劑量給予PU-H71,每周2次,持續(xù)給藥2周,對照組給予同樣體積生理鹽水。

        1.1.2實驗材料 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-6和TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購于R&D公司。Trizol購于日本TAKARA公司。RT-PCR試劑盒、qPCR試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。

        1.1.3實驗設(shè)備 光學顯微鏡(日本Olympus);恒溫培養(yǎng)箱、離心機(美國Thermo Fisher);全波長酶標儀(美國Bio-Tek);PCR儀、實時定量熒光PCR儀(美國Bio-Red)。

        1.2 方法

        1.2.1血清生化指標檢測 小鼠采取摘眼球取血,將獲得的血樣在室溫條件下3 000 rpm離心10 min,將獲得的血清嚴格按著AST、ALT、MDA和SOD檢測試劑盒說明書對血清中各酶的活性進行檢測。AST和ALT采用510 nm波長測定吸光度,MDA采用532 nm波長測定,SOD采用450 nm波長測定,根據(jù)標準曲線計算含量。

        1.2.2病理學檢測 取肝組織于4%多聚甲醛固定,經(jīng)石蠟包埋后切片,經(jīng)二甲苯進行脫蠟處理,梯度乙醇溶液清洗(100%乙醇-100%乙醇-95%乙醇-80%乙醇-75%乙醇),然后經(jīng)蒸餾水水洗,蘇木精染色后采用鹽酸乙醇進行分化,自來水浸泡后進行伊紅染色,伊紅染色后經(jīng)梯度酒精(80%乙醇-90%乙醇-95%乙醇-95%乙醇-100%乙醇-100%乙醇)、二甲苯進行脫水處理,最后經(jīng)中性樹脂封片,通過光學顯微鏡觀察并拍照。

        1.2.3血清炎癥因子檢測 小鼠采取摘眼球取血,將獲得的血樣在室溫條件下3 000 rpm離心10 min,將獲得的血清嚴格按酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明進行操作,檢測血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,經(jīng)酶標儀檢測570 nm波長的吸光度,通過標準曲線計算各炎癥因子的含量。

        1.2.4RT-PCR和qPCR檢測 將剝離的肝臟組織加入Trizol進行勻漿,提取組織RNA,然后按RT-PCR試劑盒說明進行操作,獲得cDNA,按qPCR試劑盒操作說明加入cDNA模板、引物和qPCR mix,通過Bio-red qPCR儀進行檢測。引物序列信息見表1。

        1.3 統(tǒng)計學分析

        采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,數(shù)據(jù)采用平均值±標準差來表示,采用χ2檢驗分析組間差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        表1 qPCR引物序列信息

        2 結(jié)果

        2.1 PU-H71對小鼠肝功能的影響

        取對照組和PU-H71組小鼠血清進行生化指標分析。結(jié)果見表2,在PU-H71的作用下,小鼠血清中AST、ALT的活性明顯低于對照組(P<0.05);同時,對MDA和SOD活性檢測結(jié)果見表3,PU-H71組血清中MDA活性明顯降低,而SOD活性明顯升高(P<0.05)。

        表2 PU-H71對小鼠血清AST和ALT水平的影響

        表3 PU-H71對小鼠血清MDA和SOD水平的影響

        2.2 肝組織病理學檢測

        為了進一步從形態(tài)學上確定PU-H71對小鼠肝臟的作用,對肝臟標本進行病理學觀察。對照組肝組織在腫瘤的影響下出現(xiàn)明顯的病變,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴重,肝血竇變窄,肝細胞出現(xiàn)明顯的腫脹壞死,胞漿染色變淡,出現(xiàn)明顯的氣球樣變。損傷嚴重的肝細胞只能見到細胞核,胞質(zhì)透亮。與對照組比較,PU-H71組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)更接近于正常,肝小葉結(jié)構(gòu)相對完整,肝血竇變窄程度較弱,相對清晰可見,肝細胞腫脹程度較輕,未見明顯的氣球樣變。

        2.3 PU-H71對血清炎癥因子含量的影響

        對照組和PU-H71組小鼠血清進行ELISA檢測,結(jié)果見圖1,相對于對照組,經(jīng)PU-H71處理后,小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α明顯的降低(P<0.05)。

        圖1 PU-H71對小鼠血清促炎因子的影響

        2.4 PU-H71對肝組織中線粒體自噬相關(guān)基因表達的影響

        為了確定PU-H71影響小鼠肝臟的具體機制,對小鼠肝組織中線粒體自噬相關(guān)基因的表達進行分析。結(jié)果見圖2,相對于對照組,PU-H71處理組線粒體自噬相關(guān)基因PINK、Parkin、p62和LC3的表達明顯上調(diào)(P<0.05)。

        圖2 PU-H71對肝臟細胞自噬的調(diào)控作用

        3 討論

        HSP90作為細胞內(nèi)關(guān)鍵的伴侶分子,占細胞總蛋白的1%-2%[9]。在真核生物細胞中,HSP90能夠與10%的蛋白發(fā)生相互作用,目前發(fā)現(xiàn)大約有700余種蛋白能夠與HSP90發(fā)生蛋白-蛋白直接相互作用,這表明HSP90能夠參與調(diào)控多種生物學過程,進而影響細胞的生存[10-11]。研究表明,在腫瘤組織中HSP90的表達量要顯著的高于正常組織,以保證腫瘤細胞快速增殖過程中所需蛋白的正確折疊[12-13]。因此,以抑制HSP90為靶點的研究為腫瘤的治療提供了新途徑。但是,抑制HSP90后對肝臟的影響目前尚不明確,有待進一步的研究。

        肝臟作為機體藥物代謝和排泄的主要場所,70%左右的藥物需要經(jīng)過肝臟的降解、滅火和轉(zhuǎn)化,或者經(jīng)膽汁進行排泄[14]。目前研究發(fā)現(xiàn),化療藥物均具有一定的肝臟毒性,例如順鉑能夠造成明顯的肝臟損傷[15]。因此,尋求副作用小,且治療效果好的抗腫瘤藥一直是腫瘤學領(lǐng)域亟待解決的問題。本文研究結(jié)果表明,在持續(xù)給藥2周后,相對于對照組,PU-H71組小鼠血清中肝損傷標志物AST和ALT的活性明顯降低(P<0.05),并且伴隨著MDA活性的降低和SOD活性的升高(P<0.05),說明PU-H71在抑制腫瘤增殖的情況下,能夠在一定程度上緩解腫瘤對小鼠肝臟的損傷作用。

        進一步的組織病理學觀察發(fā)現(xiàn),對照組在腫瘤的影響下肝組織出現(xiàn)了明顯的病變,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝血竇變窄,肝細胞腫脹壞死。而PU-H71組肝組織結(jié)構(gòu)相對正常,肝血竇變窄程度明顯弱于對照組,肝細胞腫脹程度明顯低于對照組,壞死的肝細胞和氣球樣變相對較少。因此,形態(tài)學結(jié)果進一步表明PU-H71能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤增殖對肝臟的損傷作用。組織損傷伴隨炎癥反應和促炎因子的分泌進一步將炎癥反應放大,過度的炎癥反應是加重組織損傷的重要原因。本研究結(jié)果表明,PU-H71能夠降低肝組織病變的同時抑制血清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達,這可能是PU-H71逆轉(zhuǎn)腫瘤所造成肝損傷的途徑。

        肝臟作為機體血液豐富的器官之一,對藥物代謝需要消耗大量的能量,線粒體數(shù)量和功能對于肝臟發(fā)揮正常作用至關(guān)重要[16-18]。而線粒體自噬是細胞清除受損線粒體的主要途徑。本文的結(jié)果表明,相對于對照組,PU-H71處理能夠促進肝組織線粒體自噬相關(guān)基因的表達,能夠有效清除受損線粒體,維持線粒體功能和肝細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。綜上所述,PU-H71在抑制腫瘤的同時,通過調(diào)控線粒體自噬逆轉(zhuǎn)腫瘤對肝臟的損傷作用,為其進一步的臨床試驗提供一定的數(shù)據(jù)支持。

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