張紹杰　　湯水福　　陳洪宇　　胡芳玉

[摘要] 目的 分析脾腎陽虛型狼瘡性腎炎（LN）患者血漿外泌體miRNA表達(dá)譜的變化及探討其可能存在的意義。方法 選取2015年8～11月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的3例脾腎陽虛型LN患者，并選取健康志愿者3名作為對照組，應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析兩組患者血漿外泌體miRNA表達(dá)譜的差異，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對結(jié)果進(jìn)行驗證。 結(jié)果 兩組的表達(dá)譜中，高顯著差異的分子包括hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497（P<0.01）;一般顯著差異的分子共6個（P<0.05）。PCR驗證結(jié)果與高通量測序一致。 結(jié)論 高顯著差異的血漿外泌體miRNA分子可能是脾腎陽虛型LN潛在的生物標(biāo)志物;差異表達(dá)的miRNA分子可能通過促進(jìn)腎纖維化、介導(dǎo)雌激素作用等參與LN的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 狼瘡性腎炎;脾腎陽虛;miRNA表達(dá)譜;高通量測序

[中圖分類號] R593.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）10-0027-04

Analysis and significance of plasma exosome miRNA expression profile in lupus nephritis of spleen-kidney yang deficiency type

ZHANG Shaojie1? ?TANG Shuifu2? ?CHEN Hongyu3? ?HU Fangyu4

1.Department of Nephrology， Dingqiao Hospital of Hangzhou， Hangzhou? ?310021， China; 2.Department of Nephrology， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou? ?510405， China; 3.Department of Nephrology， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? ?310007， China; 4.Emergency Department， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? ?310007， China

[Abstract] Objective To analyze the changes of plasma exosome miRNA expression profile in patients with lupus nephritis （LN） of spleen-kidney yang deficiency type and explore its possible significance. Methods Three LN patients with spleen-kidney yang deficiency hospitalized in The First affiliated hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine from August to November 2015 were selected. Three healthy volunteers were selected as the control group. High-throughput sequencing technique was used to analyze the difference of plasma exosome miRNA expression profile between the two groups. The results were verified by RT-PCR. Results In the expression profiles of the two groups， the molecules with high significant difference included hsa-miR-127-3p and HSA-MIR-4497 （P<0.01）. Generally， there were 6 molecules with significant differences（P<0.05）. The result of PCR was consistent with that of high-throughput sequencing. Conclusion Plasma exosome miRNA molecules with high significant difference may be potential biomarkers of LN of spleen-kidney yang deficiency type. Differentially expressed miRNA molecules may participate in the occurrence and development of LN via promoting renal fibrosis and mediating estrogenic effects.

[Key words] Lupus nephritis; Spleen-kidney yang deficiency; miRNA expression profile; High throughput sequencing

狼瘡性腎炎（Lupus nephritis，LN）是繼發(fā)性腎臟病變，其發(fā)生提示系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情嚴(yán)重。系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病因尚不完全明確，目前認(rèn)為與遺傳因素及性激素等密切相關(guān)。其主要發(fā)病機(jī)制是免疫介導(dǎo)產(chǎn)生的損傷，與多種類型的免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子等相關(guān)。

外泌體最早是由Pan等[1]通過電鏡發(fā)現(xiàn)的直徑約40～100 nm、大小均一的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)囊泡?？捎闪馨图?xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，廣泛存在于血液、尿液、唾液、腦脊液和膽汁等體液中[2-3]。已證實其在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展及診斷、治療方面均有重要的意義[4-5]。外泌體中攜帶mRNA、miRNA等物質(zhì)，能傳遞細(xì)胞間的信息，并調(diào)控各種生理活動。外泌體中的miRNA分子能調(diào)控基因的表達(dá)，必然參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程，本研究通過分析脾腎陽虛型LN患者的血漿外泌體miRNA表達(dá)譜，擬從分子生物學(xué)水平探尋此型LN潛在的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為其診斷及治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年8—11月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科住院辨證為脾腎陽虛證的LN患者3例為試驗組。①診斷標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1997年推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。脾腎陽虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2008年中華中醫(yī)藥學(xué)會腎病分會制定的《狼瘡性腎炎的診斷、辨證分型及療效評定》（試行方案）制定[7]。②納入標(biāo)準(zhǔn)：符合狼瘡性腎炎西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)脾腎陽虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡不限。③排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并高血壓、糖尿病等其他能引起腎臟損傷的疾病;排除患有混合性結(jié)締組織病者;排除患有尿路感染等感染性疾病者。排除合并有心、腦、肝和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病。另選取年齡、性別相匹配的健康志愿者3名做為對照組。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會倫理審查，納入研究患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血漿采集? 抽取每名受試者血液8 mL，EDTA抗凝，4℃下靜置3～4 h后，4000 r/min，離心15 min，收集上層血漿儲存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外泌體的提取? 收集的血漿以3000 g進(jìn)行15 min的離心，完畢后將上清液提取5 mL，然后放入無菌試管中，取1.26 mL的ExoQuick試劑加入其中（廣州銳博生物科技有限公司），并搖晃試管使之混合均勻，低溫下冷凍30 min;常溫下1500 g離心30 min，試管底的沉淀物即為外泌體。

1.2.3 總RNA的提取? 分別將兩組提取好的外泌體混合，加入1.0 mL TRIZOL試劑及0.2 mL氯仿混勻，靜置 3～5 min;4℃及10 000 g離心力的條件下離心10 min;將上清液吸取后移至另一個EP管中，然后加入0.5 mL異丙醇，混合均勻。在-20℃條件下孵育過夜;再次4℃及10 000 g離心力離心10 min，將上清液丟棄，再加入1 mL的75%乙醇，充分混合均勻，繼續(xù)在4℃及10000 g離心力下進(jìn)行10 min離心;然后在室溫下晾干，加入經(jīng)DEPC處理過的dd H2O水30 μL，溶解RNA，-80℃存用。

1.2.4 高通量測序? 用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit來構(gòu)建文庫，并用 Agilent 2200 TapeStation 進(jìn)行文庫質(zhì)檢。使用Single Read Flow Cell，根據(jù)HiSeq 2500 User Guide 提供的說明進(jìn)行HiSeq 2500上機(jī)操作，進(jìn)行single-end（1×50）標(biāo)準(zhǔn)測序程序。進(jìn)行的高通量測序及后續(xù)數(shù)據(jù)分析由廣州銳博生物科技有限公司協(xié)助完成。

1.2.5 RT-PCR驗證? 對測序結(jié)果進(jìn)行驗證。以1 μg總RNA作為反應(yīng)模版，按照BestarTM qPCR RT Kit提供的說明書規(guī)范進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配置;逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃，60 min;98℃，10 min。RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μL：Bestar SybrGreen qPCRmasterMix? 10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）及PCR Reverse Primer（10 μM）各 0.5μL，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95℃ 2 min，94℃ 20s，58℃ 20 s，40個循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo)

通過上述試驗方法檢測兩組血漿外泌體miRNA表達(dá)譜，篩選出差異顯著的miRNA分子。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用edger分析差異倍數(shù)并計算P值。差異倍數(shù)絕對值≥1即認(rèn)為兩組間存在差異，其中P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的miRNA分子

經(jīng)高通量測序后數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)共有148個miRNA分子測出的差異倍數(shù)絕對值≥1，其中131個的表達(dá)上調(diào)（表1），而表達(dá)下調(diào)的分子僅17個（表2）;其中有2個miRNA分子具有高顯著差異，分別是hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497;具有一般顯著差異的共6個，包括hsa-miR-129-5p、hsa-miR-383-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-629-3p、hsa-miR-3158-3p及hsa-miR-3184-3p;其余均為一般差異。

2.2 PCR驗證

選取高顯著差異的兩個分子hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497，行PCR檢測，驗證高通量測序的準(zhǔn)確性。PCR檢測結(jié)果顯示，hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497的表達(dá)與高通量測序結(jié)果相一致，說明高通量測序結(jié)果可靠。

3 討論

外泌體可由多種不同細(xì)胞分泌，亦相應(yīng)表達(dá)其特有的蛋白，因而可根據(jù)其特異表達(dá)的蛋白來輔助相關(guān)腎臟疾病的診斷。有研究發(fā)現(xiàn)[8]，在早期糖尿病腎病患者中，其尿液外泌體miRNA譜與單純糖尿病患者比較，miR-362-3p等分子表達(dá)上調(diào)，而miR-30d-5p等分子表達(dá)下調(diào)，并認(rèn)為可將其作為新型生物學(xué)標(biāo)志物。MiRNA分子在體內(nèi)存在廣泛，不同部位表達(dá)的分子并不相同。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，外泌體中表達(dá)的miRNA分子被認(rèn)為可用于腫瘤的診斷[9]。關(guān)于miRNA分子作為生物標(biāo)志物在LN方面的研究也有報道，在對Ⅳ型LN伴有細(xì)胞性新月體患者的一項研究發(fā)現(xiàn)，其尿液外泌體中miR-3135b等分子表達(dá)顯著異常，并證實有很好的診斷價值，診斷特異性高達(dá)83.3%～96.6%[10]。潘嫵姍等[11]證實LN患者腎組織中miR-155表達(dá)量明顯升高，而miR-200a則降低，并認(rèn)為二者可作為標(biāo)志物來評估病情。又有一項對LN的研究發(fā)現(xiàn)，尿液外泌體中miR-146a水平與疾病活動度有關(guān)系，隨疾病活動度增加而表達(dá)上調(diào)[12]，這些研究說明miRNA分子具有作為生物標(biāo)志物的潛力。

我們臨床觀察到很多LN患者起病時即表現(xiàn)為面色蒼白、全身重度浮腫、怕冷等虛證征象，通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)這類表現(xiàn)為脾腎兩虛的患者比例高達(dá)一半以上[13]，這類患者更容易出現(xiàn)腎功能下降，治療較為棘手，早期結(jié)合中醫(yī)藥治療能取得更好的效果。目前中醫(yī)方面對于LN外泌體及miRNA譜的研究較少。部分LN患者，尤其是經(jīng)過治療后的，癥狀多不典型，辨證困難，故不能較好地指導(dǎo)治療，主要是缺乏有力的客觀指標(biāo)支持，故探索特異表達(dá)的miRNA分子具有重要意義。本研究共篩選出148個特異表達(dá)的分子，其中miR-127-3p及miR-4497兩個分子較為顯著，說明二者可能是此型LN患者有意義的生物標(biāo)志物，對指導(dǎo)臨床辨證及早期治療均可能有較大價值，需后期進(jìn)一步的研究來證實。

外泌體能傳遞細(xì)胞間的信息，其中攜帶的miRNA分子能調(diào)控基因的表達(dá)，故高顯著表達(dá)的hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497兩個分子在此型LN的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。有研究證實miR-127具有保護(hù)近端腎小管功能的作用[14]，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)LN患者脾腎陽虛證較熱毒證腎間質(zhì)損害程度更重[15]，故脾腎陽虛型患者miR-127-3p升高可能是一種代償性保護(hù)機(jī)制。MiR-127還能參與免疫細(xì)胞的調(diào)控，舒嶠等[16]研究百令膠囊對LN的治療作用，發(fā)現(xiàn)其可能通過調(diào)控miR-127的表達(dá)進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞功能來達(dá)到緩解LN病情的目的?？梢妋iR-127分子通過多個方面參與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，在腎臟疾病中發(fā)揮重要作用，我們的研究結(jié)果也提示其顯著高表達(dá)，后續(xù)我們將開展進(jìn)一步的研究探討其具體的作用機(jī)制。關(guān)于miR-4497分子在免疫疾病方面也有相關(guān)研究，研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性干燥綜合征及系統(tǒng)性硬化癥患者外周血miR-4497分子表達(dá)量均下降[17-18]，但由于研究較少，其具體作用尚不清楚，但可以肯定其在LN發(fā)生發(fā)展中必然發(fā)揮重要作用。

本研究篩選出的一般顯著差異的miRNA分子在腎臟病的發(fā)病中也有重要作用。在一項關(guān)于膜性腎病的研究中，發(fā)現(xiàn)包括miR-423-5p在內(nèi)的10個差異表達(dá)的分子，并被認(rèn)為可作為潛在的診斷標(biāo)志物[19]。MiR-629分子通過增加轉(zhuǎn)錄激活子（STAT-1）的表達(dá)而導(dǎo)致系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的腎臟損害[20]。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-629等分子在腎細(xì)胞癌中過度表達(dá)，未來可能被作為治療靶點(diǎn)[21]。MiR-129分子則被證實能參與小鼠腎臟纖維化的發(fā)生[22]。脾腎陽虛型LN患者病程多較長，很多患者是由于病情遷延不愈而演變?yōu)槠⒛I陽虛證，腎臟疾病隨著病程進(jìn)展大多會出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化，所以miR-129分子很可能參與了LN腎臟纖維化的進(jìn)程，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究來探討。

本研究是對LN患者血漿外泌體中miRNA表達(dá)譜的初步研究，樣本數(shù)也較少，篩選出部分顯著表達(dá)的分子，但能否將其用于輔助診斷及辨證尚需行進(jìn)一步研究來證實。上述分子可能通過促進(jìn)腎臟纖維化、保護(hù)腎小管功能、調(diào)控信號通路等發(fā)揮其在腎臟病變中的作用，其具體的機(jī)制均是未來研究方向之一。

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（收稿日期：2020-09-22）