韓芬 楊曉
(1鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室,河南 鄭州 450000;2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科)
急性心肌梗死嚴重威脅著人類健康及生活質(zhì)量,而心肌組織缺血缺氧導(dǎo)致的心肌細胞壞死凋亡是重要原因〔1〕。缺氧在多種腫瘤細胞增殖與凋亡、新生血管形成、侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的改變中發(fā)揮重要作用,miRNA是一類長度為19~24 nt的非編碼RNA,調(diào)控其靶mRNA的翻譯和表達可以改變?nèi)毖跽T導(dǎo)腫瘤生物學(xué)行為〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-195通過下調(diào)c-myb增強缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡〔3〕;過表達miR-29b1可抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡〔4〕。而miR-194可抑制喉鱗狀細胞癌增殖〔5〕,miR-194通過調(diào)節(jié)鼠雙微粒體基因(MDM)-2表達調(diào)節(jié)卵巢癌細胞中的紫杉醇抗性〔6〕,但miR-194對缺氧的心肌細胞的影響還尚未見報道。KLFs屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子亞家族,參與早期的胚胎生長發(fā)育、細胞分化、組織器官的形成、原癌基因的突變和血管生成等生理病理過程,KLF15是KLF家族的重要成員,具有同樣的功能〔7〕。而KLF15在缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中作用尚不清楚,且miR-194與KLF15之間的調(diào)控關(guān)系也不清楚,本研究旨在探討miR-194對缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響及其可能作用的分子機制是否與KLF15有關(guān),為心肌細胞損傷及其導(dǎo)致的相關(guān)疾病治療提供新靶點和新方向。
1.1材料 心肌細胞H9C2購自中國科學(xué)院上海細胞庫;胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司;兔抗人KLF15多克隆抗體、兔抗人CyclinD1多克隆抗體、兔抗人酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3多克隆抗體、兔抗人p-STAT3多克隆抗體、兔抗人STAT3多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG均購自上海煊翎生物科技有限公司;二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒、Trizol試劑、二甲基亞砜(DMSO)購自Solarbio公司;噻唑藍(MTT試劑盒、異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)素V/碘化丙啶(AV-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶試劑盒均購自北京碧云天生物公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司;載體質(zhì)粒均由金瑞斯生物科技公司構(gòu)建;酶標儀購自南京德鐵實驗設(shè)備公司。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇H9C2細胞,使用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2、95%O2條件下培養(yǎng);2 d換液1次,取處于對數(shù)生長期的細胞進行試驗。
1.2.2細胞轉(zhuǎn)染和分組 將心肌細胞隨機分為兩組,空白對照(Control)組:不做任何處理;單純?nèi)毖踅M:將心肌細胞用無血清低糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),置于持續(xù)充入95%N2+5%CO2的密閉培養(yǎng)箱中進行缺氧處理48 h。
將miR-con、miR-194、anti-miR-con、anti-miR-194、pcDNA和pcDNA-KLF15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到正常培養(yǎng)的心肌細胞中,記為miR-con組、miR-194組、anti-miR-con組、anti-miR-194組、pcDNA組和pcDNA-KLF15組;再將anti-miR-con組、anti-miR-194組、pcDNA組和pcDNA-KLF15組細胞進行缺氧處理,記為缺氧+anti-miR-con組、缺氧+anti-miR-194組、缺氧+pcDNA組和缺氧+pcDNA-KLF15組。
將miR-194質(zhì)粒分別和pcDNA質(zhì)粒、pcDNA-KLF15質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到正常培養(yǎng)的心肌細胞中再行缺氧處理,記為缺氧+miR-194+pcDNA組和缺氧+miR-194+pcDNA-KLF15組;將anti-miR-194質(zhì)粒分別和si-con質(zhì)粒、si-KLF15質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到正常培養(yǎng)的心肌細胞中再做缺氧處理,分別記為缺氧+anti-miR-194+si-con組和缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組;轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。
1.2.3qRT-PCR檢測細胞miR-194和KLF15 mRNA水平 用Trizol試劑提取總RNA,分別使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并避光配制反應(yīng)體系,以β-actin為內(nèi)參進行PCR擴增,循環(huán)條件為95℃ 30 s,60℃ 30 s;72℃ 30 s,共40個循環(huán);60℃延長5 min。每個樣品重復(fù)3次,采用2-△△Ct法分析GPX1 mRNA相對表達量。
1.2.4Western印跡檢測蛋白表達水平 收集以上各組細胞,加入RIPA細胞裂解液于冰上裂解30 min;4℃,12 000 r/min離心15 min,取上清。BCA試劑盒測定蛋白樣品濃度后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳結(jié)束后,將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h;分別加入兔抗人KLF15多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人p-STAT3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人STAT3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人酶切caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人CyclinD1多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶1 000),4℃ 過夜;洗膜后,加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000),室溫孵育2 h;TBST洗膜3次,10 min/次。后在暗室中曝光顯影,再浸入定影,最后洗去殘液晾干,將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理,測定各組蛋白條帶的吸光度,以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平,實驗重復(fù)3次。
1.2.5MTT檢測細胞增殖 在以上各組細胞培養(yǎng)至48 h時加入20 μl(5 g/L)的MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h;棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min,酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細胞增殖存活率(%)=實驗組A值/空白對照組A值×100%。
1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取各組細胞,胰蛋白酶消化后4℃、300 r/min離心10 min,預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸。按照AV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書,分別加入5 μl AV-FITC和10 μl PI,輕輕混勻后室溫避光孵育15 min,流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度,實驗重復(fù)3次。
1.2.7熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-194對KLF15的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示KLF15 3'UTR區(qū)域有miR-324-5p結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點KLF15的3'UTR-熒光素酶表達載體(WT-KLF15和MUT-KLF15),取對數(shù)生長期心肌細胞H9C2接種于24孔板(1×103個/孔),待細胞生長至80 %匯合時,用LipofectamineTM2000分別將WT-KLF15和MUT-KLF15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到H9C2,同時分別轉(zhuǎn)染miR-194質(zhì)粒和miR-con質(zhì)粒。依據(jù)說明書要求,使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定,實驗結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗重復(fù)3次。
1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。
2.1缺氧處理心肌細胞對miR-194和KLF15表達的影響 Western印跡檢測結(jié)果顯示,與Control組相比,缺氧組心肌細胞中KLF15蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)??梢姡毖跆幚泶龠M心肌細胞中miR-194的表達,抑制KLF15的表達。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與Control組相比,缺氧組心肌細胞中miR-194的表達水平顯著升高,KLF15 mRNA的表達水平顯著降低(均P<0.05)。見圖1,表1。
圖1 檢測心肌細胞中KLF15蛋白表達
表1 缺氧處理心肌細胞影響miR-194和KLF15表達
2.2抑制miR-194表達促進缺氧處理心肌細胞存活和抑制細胞凋亡 Western印跡檢測結(jié)果顯示,與Control組相比,缺氧組心肌細胞中酶切caspase-3蛋白表達水平顯著升高,CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05);與缺氧+anti-miR-con組相比,缺氧+anti-miR-194組心肌細胞中酶切caspase-3蛋白表達水平顯著降低,CyclinD1蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與Control
組相比,缺氧組心肌細胞中miR-194表達水平顯著升高,與缺氧+anti-miR-con組相比,缺氧+anti-miR-194組心肌細胞中miR-194表達水平顯著降低(均P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果顯示,與Control組相比,缺氧組心肌細胞存活率顯著降低(P<0.05),與缺氧+anti-miR-con組相比,缺氧+anti-miR-194組心肌細胞存活率顯著升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,與Control組相比,缺氧組心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與缺氧+anti-miR-con組相比,缺氧+anti-miR-194組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2、表2??梢姡种苖iR-194表達促進缺氧處理心肌細胞存活和抑制細胞凋亡。
1~4:Control組,缺氧組,缺氧+anti-miR-con組,缺氧+anti-miR-194組圖2 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡
表2 轉(zhuǎn)染anti-miR-194促進缺氧處理心肌細胞存活并抑制細胞凋亡
2.3miR-194靶向調(diào)控KLF15的表達 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到KLF15與miR-194存在結(jié)合位點,見圖3A。熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,相較于miR-con組,miR-194組WT-KLF15的心肌細胞H9C2熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);而MUT-KLF15的心肌細胞H9C2熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)。見表3。Western印跡結(jié)果顯示,相較于miR-con組(0.54±0.04),miR-194組(0.23±0.03)心肌細胞H9C2中KLF15表達顯著降低(P<0.05);而相較于anti-miR-con組(0.49±0.05),anti-miR-194組(0.84±0.07)心肌細胞H9C2中KLF15表達顯著升高(P<0.05)。見圖3B可見,miR-194靶向調(diào)控KLF15的表達。
2.4過表達KLF15促進缺氧處理心肌細胞增殖和抑制細胞凋亡 Western印跡結(jié)果顯示,與缺氧+pcDNA組相比,缺氧+pcDNA-KLF15組心肌細胞中KLF15和CyclinD1蛋白表達水平均顯著升高(均P<0.05),酶切caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果顯示,與缺氧+pcDNA組相比,缺氧+pcDNA-KLF15組心肌細胞存活率顯著升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,與缺
氧+pcDNA組相比,缺氧+pcDNA-KLF15組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。可見,過表達KLF15促進缺氧處理心肌細胞增殖及抑制細胞凋亡。見表4,圖4。
1~4:miR-con組,miR-194組,anti-miR-con組,anti-miR-194組圖3 KLF15的3'UTR中含有與miR-194互補的核苷酸序列
表3 雙熒光素酶報告實驗
表4 過表達KLF15促進缺氧處理心肌細胞增殖和抑制細胞凋亡
1,2:缺氧+pcDNA組,缺氧+pcDNA-KLF15組圖4 檢測心肌細胞中KLF15蛋白表達
2.5沉默KLF15部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-194對缺氧處理心肌細胞的保護作用 Western印跡結(jié)果顯示,與缺氧+anti-miR-con組相比,缺氧+anti-miR-194組心肌細胞中KLF15和CyclinD1蛋白表達水平均顯著升高(均P<0.05),酶切caspase-3蛋白表達水平顯
著降低(均P<0.05);與缺氧+anti-miR-194+si-con組相比,缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組心肌細胞中KLF15和CyclinD1蛋白表達水平顯著降低,酶切caspase-3蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果顯示,與缺氧+anti-miR-con組相比,缺氧+anti-miR-194組心肌細胞存活率顯著升高(P<0.05);與缺氧+anti-miR-194+si-con組相比,缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組心肌細胞存活率顯著降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,與缺氧+anti-miR-con組相比,缺氧+anti-miR-194組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與缺氧+anti-miR-194+si-con組相比,缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表5、圖5??梢?,沉默KLF15部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-194對缺氧處理心肌細胞的保護作用。
表5 沉默KLF15部分逆轉(zhuǎn)降低miR-194對缺氧處理心肌細胞的保護作用
1~4:缺氧+anti-miR-con組,缺氧+anti-miR-194組, 缺氧+anti-miR-194+si-con組,缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組圖5 檢測心肌細胞中KLF15蛋白表達
2.6miR-194調(diào)控KLF15對STAT3和p-STAT3的表達 Western印跡結(jié)果顯示,與Control組相比,缺氧組心肌細胞中p-STAT3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),而STAT3蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05);與缺氧+miR-con組相比,缺氧+miR-194組心肌細胞中p-STAT3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),STAT3蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05);與缺氧+miR-194+pcDNA組相比,缺氧+miR-194+pcDNA-KLF15組心肌細胞中p-STAT3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),STAT3蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)。見圖6、表6。可見,上調(diào)KLF15表達部分逆轉(zhuǎn)miR-194對缺氧處理心肌細胞中p-STAT3蛋白表達的抑制作用。
1~6:Control組,缺氧組,缺氧+anti-miR-con組,缺氧+anti-miR-194組,缺氧+anti-miR-194+si-con組,缺氧+anti-miR-194+si-KLF15組圖6 檢測心肌細胞中STAT3和p-STAT3的表達
表6 miR-194調(diào)控KLF15對STAT3和p-STAT3的表達
急性心肌梗死是一種常見的心肌壞死型心血管急危重病,有發(fā)病急、病程短及死亡率高等特點,主要由冠狀動脈急性或持續(xù)性缺氧所引發(fā)〔8〕。 miRNAs是心血管疾病新的標志物,急性心肌梗死、心肌病、心律失常和動脈血管硬化等疾病的病理改變早期有miRNA分子的參與,miRNA在其中發(fā)揮重要作用〔9〕。篩選缺氧性心肌病相關(guān)的miRNA,探討miRNA的作用分子機制,對其診斷、治療和預(yù)后具有指導(dǎo)意義。已有研究表明miR-182〔10〕、miR-19a-3p〔11〕等參與心肌細胞的缺氧壞死過程。miR-499可通過活化PI3K/Akt信號通路減少缺氧/復(fù)氧所誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡〔12〕。miR-194通過調(diào)節(jié)IGF-1R/Akt信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和糖代謝能力〔13〕;miR-194通過負向調(diào)控RBX1表達,從而抑制胃癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移,促進細胞凋亡和細胞周期的阻滯〔14〕。miR-194在黑色素瘤細胞中低表達,miR-194表達上調(diào)可促進黑色素瘤細胞凋亡并抑制黑色素瘤細胞的增殖,其機制可能與下調(diào)CyclinD1蛋白及上調(diào)酶切caspase-3蛋白表達有關(guān)〔15〕。缺氧會調(diào)控miR-194-1啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控〔16〕。本研究結(jié)果表明,缺氧處理的心肌細胞中miR-194高表達,抑制miR-194表達促進缺氧處理的心肌細胞存活并抑制細胞凋亡。
Krüppel樣因子KLF15是Cys2/His2鋅指DNA結(jié)合蛋白的成員,在細胞的生長、分化、凋亡等生理過程發(fā)揮重要作用,研究發(fā)現(xiàn)KLF15抑制肺腺癌細胞的生長,可作為肺腺癌患者的治療靶點和預(yù)后分子標志物〔17〕。KLF15通過上調(diào)CDKN1A/p21和CDKN1C/p57表達抑制胃癌細胞的細胞增殖〔18〕。KLF15過表達通過抑制結(jié)締組織生長因子保護嚙齒動物模型中β-氨基丙腈誘導(dǎo)的主動脈破裂〔19〕。KLF15通過調(diào)節(jié)細胞死亡和抑制Akt/ mTOR信號傳導(dǎo)來預(yù)防異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大〔20〕。KLF15可通過反饋調(diào)節(jié)TGF-β,抑制CTGF及MRTF-A的作用,減輕心肌間質(zhì)纖維化及心肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)變,從而改善心功能〔21〕。然而KLF15在心肌細胞中的作用機制還尚未完全清楚,本研究結(jié)果顯示,缺氧處理的心肌細胞中KLF15低表達,過表達KLF15促進缺氧處理的心肌細胞存活并抑制細胞凋亡。
周舟〔22〕研究發(fā)現(xiàn)caspase-3激活在缺氧誘導(dǎo)心肌細胞凋亡過程中具有重要作用,缺氧可上調(diào)心肌細胞caspase-3基因表達,而本研究結(jié)果顯示,缺氧心肌細胞中酶切caspase-3蛋白的表達水平顯著升高,而miR-194抑表達和KLF15過表達會使降低缺氧心肌細胞中酶切caspase-3蛋白的表達,證實了前人研究結(jié)果。而且有關(guān)miR-194與KLF15的調(diào)控關(guān)系及它們對缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響還鮮有報道,而本研究發(fā)現(xiàn)miR-194靶向負調(diào)控KLF15的表達。沉默KLF15部分逆轉(zhuǎn)miR-194抑制表達對缺氧處理心肌細胞的保護作用;過表達KLF15部分逆轉(zhuǎn)miR-194過表達對缺氧處理心肌細胞中p-STAT3蛋白表達的促進作用。
綜上,抑制miR-194表達能降低缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷,其機制可能與調(diào)控KLF15及p-STAT3蛋白的表達相關(guān),為心肌細胞損傷的治療提供新思路和新靶點。