樊赟 樊紀(jì)民 卞華

(1南陽理工學(xué)院 河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473000;2河南省南陽市臥龍區(qū)中醫(yī)藥管理局)

肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌(PLC)的病理類型之一，占比達(dá)90%以上，肝癌發(fā)病率居世界癌癥發(fā)病率第五位，致死率居第二位〔1〕，我國肝細(xì)胞癌發(fā)病率占世界總數(shù)的55%〔2〕，且發(fā)病率逐年增加。近年，腫瘤分子靶向治療成為肝癌治療的熱點(diǎn)，臨床上細(xì)胞分子靶向治療對于肝癌，尤其是晚期階段發(fā)揮重要作用〔3〕。肝細(xì)胞生長因子(HGF)由肝臟間葉細(xì)胞分泌，可調(diào)控多種組織及細(xì)胞增殖分化，如啟動肝再生、促細(xì)胞分裂、運(yùn)動、抗凋亡等〔4〕。HGF主要通過與c-met形成二聚體，激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)等通路，發(fā)揮其生物學(xué)功能〔5〕。miRNA是一種單鏈非編碼小分子RNA，它可調(diào)控人類基因組中約三分之一基因的表達(dá)，研究表明，近一半已知miRNAs與腫瘤相關(guān)，發(fā)揮致癌或抑癌作用〔6〕。本研通過分析miR-144對靶基因HGF調(diào)控作用，為診斷及治療肝癌提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1組織樣本采集 收集2016年12月至2018年5月就診于南陽理工學(xué)院附屬醫(yī)院病理科確診為肝癌的患者69例，其中男51例，女18例，平均年齡(55.29±8.41)歲。采集肝癌組織及匹配癌旁組織，肝癌組織均由病理學(xué)醫(yī)師共同診斷，且取樣前未行放化療。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 清晨空腹采集肝癌患者外周靜脈血3 ml，1 000 r/min離心10 min，采集血清，-80℃保存待測。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-144表達(dá)量 取0.5 ml血清標(biāo)本，采用Trizol法提取血清總RNA，進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟均按照試劑盒中說明書進(jìn)行。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 肝癌細(xì)胞SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2及人肝上皮細(xì)胞THLE-3均購自上海中科院細(xì)胞庫。測定及比較上述細(xì)胞中miR-144表達(dá)量、HGF mRNA及蛋白表達(dá)。選取MHCC97H細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DMEM培養(yǎng)基(37℃，5%CO2)培養(yǎng)MHCC97H細(xì)胞，分為miR-NC組、miR-144組、miR-144+HGF組，分別轉(zhuǎn)染陰性對照miRNA模擬物(mimics)、miR-144 mimics、miR-144 mimics+HGF，均根據(jù)LipofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.4熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn) 經(jīng)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫，預(yù)測出miR-144與HGF的可能結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建HGF野生型3′-UTR熒光素酶質(zhì)粒pMIR-WT和突變型質(zhì)粒pMIR-Mut。將MHCC97H細(xì)胞進(jìn)行分組，分別轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒pMIR-WT、突變型質(zhì)粒pMIR-Mut與miR-144 mimics和陰性對照miRNA mimics。檢測各組熒光素酶活性。

1.2.5Western印跡檢測 經(jīng)分離凝膠蛋白電泳(電壓120 V)與濃縮膠蛋白電泳(電壓80 V)進(jìn)行蛋白分離，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，TBST室溫下封閉1 h，加入HGF抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)，GAPDH為內(nèi)參，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Millipore公司)顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描，Get Image System軟件進(jìn)行分析。

1.2.6CCK8檢測 將miR-NC組、 miR- 144組及miR-144+HGF組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加10 ml CCK8，詳細(xì)步驟按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行，480 nm波長處測定OD值。

1.2.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測 將miR-NC 組、 miR- 144組及miR-144+HGF組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，24 h待細(xì)胞長成單層棄去培養(yǎng)液，在孔中央進(jìn)行劃痕，顯微鏡下拍照，測量并計算24 h細(xì)胞遷移距離。

1.2.8流式細(xì)胞法檢測 取miR-NC組、miR-144組、miR-144+HGF組細(xì)胞通過胰蛋白酶消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，以2×104個/ml濃度接種于24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入50 ng/ml的HGF。待消化后收集細(xì)胞，并通過離心棄除上清液，以PBS洗滌2次，緩沖液懸浮細(xì)胞，加入膜聯(lián)蛋白V，混勻，再加入核酸熒光染料碘化丙啶，混勻后避光反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.9構(gòu)建肝癌裸鼠模型 8只裸鼠，75%酒精常規(guī)消毒后肢，4號注射針經(jīng)皮穿刺，將陰性對照miRNA mimics (miR-NC組)，miR-144 mimics轉(zhuǎn)染(miR-144組)進(jìn)MHCC97H細(xì)胞并注射到裸鼠皮下(0.2 ml，約含細(xì)胞2×107個)，正常飼養(yǎng)，每日給藥1次，隔日稱重，10 d后眼球取血，以頸椎脫臼法將其處死，剝?nèi)∧[瘤組織，置甲醛固定。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肝癌患者細(xì)胞中miR-144的表達(dá)量 肝癌組織中miR-144表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織〔(0.28±0.09)vs(1.00±0.21)〕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.458，P=0.005)。miR-144在THLE-3、SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中的表達(dá)量分別為(1.00±0.21)、(0.71±0.17)、(0.34±0.03)、(0.52±0.06)和(0.58±0.13)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.613，P=0.002)。SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中miR-144的表達(dá)量均明顯低于THLE-3，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.335，22.412，18.211，17.336；P均<0.001)。

2.2miR-144通過結(jié)合HGF的3′-UTR來抑制HGF的表達(dá) miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，HGF為miR-144潛在靶基因(圖1)。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，對于WT-HGF野生型報告基因質(zhì)粒，miR-144組的熒光素酶活性明顯低于miR-NC組〔(17.61±1.12)vs(33.42±1.37),t=15.47，P=0.001〕。對于Mut-HGF突變型報告基因質(zhì)粒，兩組熒光素酶活性無顯著差異〔(35.32±3.42) vs (33.42±3.31);t=0.691,P=0.527〕。

miR-144組HGF mRNA表達(dá)水平明顯低于miR-NC組〔(0.39±0.05)vs(1.0±0.21)，t=4.894，P=0.0081<0.01〕。Western印跡檢測結(jié)果顯示，miR-144組HGF蛋白表達(dá)水平較miR-NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔(0.34±0.13)vs(1.0±0.21)，t=4.628，P<0.01〕。見圖2。上述結(jié)果說明，miR-144能夠抑制HGF mRNA及蛋白表達(dá)。

圖1 HGF為miR-144的潛在靶基因

圖2 Western印跡法檢測HGF蛋白表達(dá)

2.3HGF在肝癌組織及細(xì)胞中mRNA及蛋白的表達(dá) HGF在THLE-3、SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中mRNA的表達(dá)量分別為(1.0±0.17)、(1.27±0.21)、(1.54±0.26)、(1.47±0.16)和(1.86±0.27)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.416，P=0.008)。SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中HGF mRNA的表達(dá)量均明顯高于THLE-3(t=17.554，22.478，25.231，28.406；P均<0.001)。

肝癌腫瘤組織中HGF mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織〔(2.32±0.41)vs(1.0±0.23)，t=23.32，P<0.01〕。

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤組織中、癌旁正常組織中HGF陽性染色細(xì)胞數(shù)分別為(125.50±16.66)個/HP、(37.42±3.58)個/HP，HGF在腫瘤組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(t=42.936，P<0.001)，見圖3。以上結(jié)果表明，HGF可促進(jìn)肝癌的發(fā)展，而miR-144通過抑制HGF的表達(dá)參與肝癌的進(jìn)展。

圖3 HGF在肝癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)(IHC，×25)

2.4miR-144和HGF與細(xì)胞增殖，遷移及周期的相關(guān)性 miR-NC組、miR-144組、miR-144+HGF組的OD值分別為(0.69±0.15)、(0.58±0.12)、(1.34±0.19)。miR-144組的OD值低于miR-NC組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.992，P=0.377)。miR-144+HGF組的OD值明顯高于miR-144組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.858，P=0.004)。

流式細(xì)胞法檢測發(fā)現(xiàn)，miR-144組S期細(xì)胞比值〔(14.46±2.33)%〕低于miR-NC組〔(19.11±3.05)%〕，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.098，P=0.104)。而miR-144+HGF組S期細(xì)胞比值〔(24.54±2.66)%〕明顯高于miR-144組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.937，P=0.008)。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，12 h后miR-NC組、miR-144組、miR-144+HGF組的細(xì)胞遷移個數(shù)分別為(185.62±22.33)個、(35.42±6.66)個、(210.33±19.56)個。miR-144組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.164，P<0.001)。miR-144+HGF組細(xì)胞遷移數(shù)明顯高于miR-144組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.662，P<0.001)。見圖4。以上結(jié)果表明，miR-144可抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H的增殖，遷移和細(xì)胞周期在S期聚集，而這些抑制效果可被HGF補(bǔ)回。

圖4 各組細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(×40)

2.5miR-144抑制裸鼠皮下腫瘤進(jìn)程 miR-144組腫瘤組織重量明顯低于miR-NC組〔(0.14±0.06) vs (0.52±0.11)g〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.429，P<0.001)。miR-144在miR-144組中的表達(dá)量明顯高于miR-NC組〔(7.56±1.02) vs (1.0±0.12)〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.65，P<0.001)。HGF在miR-144組中的表達(dá)量明顯低于miR-NC組〔(0.38±0.05) vs (1.0±0.13)〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.922，P<0.001)。

Ki67染色結(jié)果顯示，miR-NC組、miR-144組的Ki67陽性染色細(xì)胞數(shù)分別為(69.35±10.32)個/HP、(16.99±3.47)個/HP，miR-144組的Ki67陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.602，P<0.001)。見圖5。

HE染色結(jié)果顯示，miR-NC組、miR-144組的陽性染色細(xì)胞數(shù)分別為(112.49±15.02)個/HP、(52.33±6.32)個/HP，miR-144組的陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.442，P<0.001)。見圖5。以上結(jié)果說明miR-144能夠抑制HGF表達(dá)并抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

圖5 miR-144抑制裸鼠皮下腫瘤進(jìn)程(×40)

3 討 論

目前研究示HCC、肝內(nèi)膽管癌及混合性肝癌等為PLC主要病理類型，其中HCC占比達(dá)90%以上〔7〕。肝癌在發(fā)展中國家的發(fā)病率遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國家，我國則是其發(fā)病率及死亡率較高的國家之一〔8〕。

miRNA在人類基因表達(dá)及腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，其中miR-144在多種腫瘤中均發(fā)揮抑制作用。研究表明，在肺癌中，miR-144可通過控制凋亡調(diào)節(jié)因子的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡〔9〕；在肝癌中，通過對肝癌組織和細(xì)胞中檢測發(fā)現(xiàn)，miR-144可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(E2F)3的表達(dá)，對肝癌細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響〔10〕。本研究結(jié)果證實(shí)，miR-144在腫瘤組織比癌旁正常組織中的表達(dá)量降低，并且在構(gòu)建肝癌皮下種植裸鼠模型中，也發(fā)現(xiàn)miR-144在肝癌內(nèi)表達(dá)量顯著降低。這表明miR-144對肝癌有相關(guān)調(diào)控作用。

HGF具有多種生物學(xué)功能，常通過自分泌或旁分泌的形式作用于包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種上皮細(xì)胞，能刺激肝細(xì)胞DNA的合成，促進(jìn)肝再生，同時還能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動及血管形成〔11〕。尤其在肝癌切除術(shù)后，HGF分泌活躍，誘導(dǎo)特異性跨膜受體c-Met過量表達(dá)，促使了肝癌復(fù)發(fā)，因此抑制HGF/c-met信號傳導(dǎo)通路對減少肝癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，HGF可以激活Bcl-2基因表達(dá)、下調(diào)Bax蛋白活性，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用〔13〕。HGF還可通過刺激血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1及c-Met在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管形成。HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在人體內(nèi)正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用〔14,15〕。在致癌性轉(zhuǎn)化過程中Met活性調(diào)節(jié)可能與正常的c-Met活性調(diào)節(jié)完全不同。研究發(fā)現(xiàn)，Met基因缺失的小鼠表現(xiàn)為因肝臟和胎盤發(fā)育嚴(yán)重缺陷導(dǎo)致胚胎致死，其特點(diǎn)與小鼠HGF基因缺失表現(xiàn)十分相似。HGF/c-Met信號通路可以在多個胚胎組織中調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生和浸潤性生長〔16〕。本研究結(jié)果說明miR-144能夠抑制HGF的表達(dá)量并抑制肝癌細(xì)胞的增殖，這預(yù)示miR-144能夠通過抑制HGF的表達(dá)，從而抑制肝癌的發(fā)展。

綜上所述，miR-144可抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H的增殖，遷移和細(xì)胞周期在S期聚集，而這些抑制效果可被HGF補(bǔ)回，而miR-144能夠抑制HGF的表達(dá)并抑制肝癌細(xì)胞的增殖，對肝癌有抑制效果。