高涵 吳琦 陳宏月 郭紅艷 周濤 劉哲丞

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2附屬第一醫(yī)院普通外科)

血紅素加氧酶(HO)能催化血紅素分解生成膽綠素，是血紅素分解的限速酶。HO有3種亞型：HO-1、HO-2和HO-3，它們?cè)诨窘Y(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)節(jié)和組織分布中有很大差異。HO-1是Wise等〔1〕最先在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的一種能降解血紅素的酶，命名為HO-1，HO-1可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Llesuy等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)這種酶可能具有細(xì)胞保護(hù)作用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種人類腫瘤有細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)E基因的擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)，可協(xié)同某些癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞和增強(qiáng)細(xì)胞的癌變傾向。Peng等〔3〕研究了CyclinD1和CyclinE異常表達(dá)及在肝癌中的作用，發(fā)現(xiàn)71例肝癌患者中有40例 CyclinE過(guò)度表達(dá)，且與低分化肝癌密切相關(guān)，提示CyclinE異常表達(dá)與肝癌生物學(xué)行為有關(guān)。p27是一個(gè)廣譜細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制因子，它作為細(xì)胞周期的抑制劑，主要是通過(guò)與CDK或Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，從而對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。此外，p27能夠促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖〔4〕。在以往的研究〔5,6〕中發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中HO-1是高表達(dá)的。在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)mtHO-1G143H轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)了多臟器腫瘤，此結(jié)果提示HO-1突變體的表達(dá)可能會(huì)影響細(xì)胞的增殖能力。本研究主要探討HO-1對(duì)肝癌細(xì)胞CyclinE、p27的影響。

1 材料與方法

1.1材料 肝癌細(xì)胞系HepG2、質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和pCAAG由本實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清、1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；限制性核酸內(nèi)切酶Bam HⅠ/EcoRⅠ購(gòu)于美國(guó)NEB公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；小鼠抗HO-1抗體購(gòu)于德國(guó)默克公司；兔抗β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruzs公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠二抗和HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.2重組載體的構(gòu)建 將構(gòu)建的重組載體pCAAG-wtHO-1和pCAAG-mtHO-1-G143中的野生型HO-1(wt)和突變型HO-1(G143H)基因亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)wtHO-1、pcDNA3.1(+)mtHO-1G143H。插入片段大小為1 122 bp。

1.2.1引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增wtHO-1/mtHO-1G143H片段的引物序列：上游引物：5′-CCGGATCCTCCAGAGTTTCCGCATACAACC-3′ ，下游引物：5′-CGGAATTCAGAAAGGAAACACAGGGAGTGG-3′ ，上游下游引物分別引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸45 s。30個(gè)循環(huán)后于72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果。

1.2.2載體與目的片段連接 載體∶目的片段=1∶3,用T4連接酶16℃過(guò)夜轉(zhuǎn)化。

1.2.3制備感受態(tài)細(xì)胞 用接種環(huán)取凍結(jié)的DH5α菌種在平板培養(yǎng)基上劃線，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落置10 ml LB培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)，120 r/min振蕩過(guò)夜，次日取菌液1 ml接種到含有100 ml LB培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)的錐形瓶中，37℃ 170 r/min劇烈振搖培養(yǎng)2～3 h待OD值為0.3～0.4，取出后立即冰浴10～15 min，無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至滅菌的冰預(yù)冷的50 ml離心管中，4℃離心，4 000 r/min 10 min，棄去上清，將離心管倒置于濾紙上1 min，加入冰預(yù)冷的0.1 mol/L氮化鈣(CaCl2) 10 ml重懸菌體，4℃，4 000 r/min離心10 min，棄上清，倒置于濾紙上1 min，每50 ml培養(yǎng)物加冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl22 ml，每管200 μl分裝+20%滅菌甘油，-80℃保存。

1.2.4細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)菌解凍，立即吸取20 μl轉(zhuǎn)移至1.5 ml無(wú)菌EP管中，每管加質(zhì)粒50～100 ng，其中包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(無(wú)菌水)、目的質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)混合內(nèi)容物，放置冰上30 min，42℃保溫(熱休克)60 s，置于冰上1～2 min，加入180 μl無(wú)抗生素LB培養(yǎng)基，37℃搖床120 r/min振搖45～90 min，將200 μl菌液鋪于100 μg/ml含氨芐青霉素的瓊脂平板，室溫平放10 min，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆將其放入LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素)中37℃搖床110 r/min震蕩過(guò)夜。應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，提取后酶切鑒定。選擇T7測(cè)序引物，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3HepG2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及HO-1鑒定

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、pH值為7.2～7.4的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于24孔板，細(xì)胞融合至60%～70%時(shí)，加入含有不同濃度的G418培養(yǎng)液，14 d左右根據(jù)細(xì)胞死亡情況確定G418對(duì)HepG2細(xì)胞的最小致死劑量。

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，分為四組：空白對(duì)照組；pCDNA3.1(+)空質(zhì)粒組；pCDNA3.1-wt HO-1轉(zhuǎn)染組；pCDNA3.1-mtHO-1G143H轉(zhuǎn)染組，進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。

1.3.3HO-1鑒定 選取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中外源性wtHO-1、mtHO-1G143H基因的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)RT-PCR結(jié)果，選取在mRNA表達(dá)水平上過(guò)表達(dá)wtHO-1較多的5號(hào)克隆和mtHO-1G143H的7號(hào)克隆，轉(zhuǎn)染空載體1號(hào)克隆，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以HO-1的特異性單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡。

1.4檢測(cè)CyclinE、p27 mRNA水平的變化 提取總RNA，將提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，β-actin作為內(nèi)參照。CyclinE引物序列：上游引物：5′-CAGGGTATCAGTGGTGCGACA-3′，下游引物：5′-CTGCTTCTTACCGCTCTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為232 bp。擴(kuò)增條件為：94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。p27引物序列：上游引物：5′-CCTGGAGCGGATGGAC-3′，下游引物：5′-CCTCTTGCCACTCGTACTTGC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為240 bp。擴(kuò)增條件為：94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1重組載體的鑒定 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mtHO-1G143H質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，見(jiàn)圖1，產(chǎn)物符合pcDNA3.1(+)線性片段(5 400 bp)和目的基因wtHO-1/mtHO-1G143H受體片段(1 122 bp)的長(zhǎng)度。將含有重組質(zhì)粒的DH5α菌液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。與Genbank中的HO-1cDNA(NM010443)序列進(jìn)行比對(duì)，序列完全一致，突變體也和預(yù)期完全一致。證明重組載體構(gòu)建成功。

1：pcDNA3.1(+)-wtHO-1質(zhì)粒；2：pcDNA3.1(+)-mtHO-1G143H質(zhì)粒；M：Marker圖1 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/mtHO-1G143H質(zhì)粒雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳

2.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞外源性HO-1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的5個(gè)HepG2細(xì)胞克隆可見(jiàn)目的條帶(長(zhǎng)度為240 bp)。表明pcDNA3.1(+)-wtHO-1質(zhì)粒已整合到該5個(gè)細(xì)胞克隆的基因組中，并在mRNA水平上表達(dá)。見(jiàn)圖2。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的3個(gè)HepG2細(xì)胞克隆中可見(jiàn)目的條帶。表明pcDNA3.1(+)-mtHO-1G143H質(zhì)粒已整合到該3個(gè)細(xì)胞克隆的基因組中，并在mRNA水平得以表達(dá)。見(jiàn)圖3。

2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 在分子量為32 kD附近檢測(cè)出目的條帶。轉(zhuǎn)染空載體的HepG2細(xì)胞幾乎看不到目的條帶，而穩(wěn)定表達(dá)wtHO-1和mtHO-1G143H的細(xì)胞系中HO-1蛋白表達(dá)豐度很高，說(shuō)明實(shí)現(xiàn)了HO-1蛋白的過(guò)表達(dá)。見(jiàn)圖4。

2.4HO-1活性改變對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控因子CyclinE、p27 mRNA表達(dá)水平的影響 HO-1高活性細(xì)胞系和HO-1低活性細(xì)胞系中的CyclinE、p27的mRNA的表達(dá)水平與空載體細(xì)胞相比存在差異。見(jiàn)圖5、表1。

M：Marker；1：轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞；2～6：轉(zhuǎn)染wtHO-1細(xì)胞圖2 轉(zhuǎn)染wtHO-1 mRNA表達(dá)水平

M：Marker；1：轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞；2～6：轉(zhuǎn)染mtHO-1G143H細(xì)胞圖3 轉(zhuǎn)染mtHO-1G143HmRNA表達(dá)水平

1：轉(zhuǎn)染空載體HepG2細(xì)胞；2：穩(wěn)定表達(dá)mtHO-1G143H的7號(hào)細(xì)胞；3：穩(wěn)定表達(dá)wtHO-1的5號(hào)細(xì)胞圖4 Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞HO-1、HO-1(G143H)蛋白表達(dá)水平

1：轉(zhuǎn)染空載體HepG2細(xì)胞；2：穩(wěn)定表達(dá)wtHO-1的5號(hào)細(xì)胞；3：穩(wěn)定表達(dá)mtHO-1G143H的7號(hào)細(xì)胞圖5 HO-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中CyclinE、p27 mRNA表達(dá)水平

表1 p27、CyclinE半定量

3 討 論

HO-1是誘導(dǎo)型HO，是血紅素分解的關(guān)鍵酶，它在炎癥、免疫、氧化應(yīng)激、細(xì)胞調(diào)節(jié)及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。它的生理作用是既可以清除過(guò)多的血紅素，又可以通過(guò)其分解產(chǎn)物(膽綠素、CO和Fe2+)發(fā)揮抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等作用。Hirai等〔5，6〕研究發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤中能檢測(cè)到HO-1高表達(dá)，抑制HO-1的表達(dá)能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)；Fang〔7〕等研究發(fā)現(xiàn)，HO-1的表達(dá)增強(qiáng)了胰腺癌的侵蝕性，主要是通過(guò)加快腫瘤生長(zhǎng)和血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)的；有學(xué)者〔8〕研究提出HO-1的高表達(dá)具有抗氧化作用，保護(hù)癌細(xì)胞，利用藥物抑制HO-1的表達(dá)，將成為治療癌癥的一種方法。也有一些文章報(bào)道HO-1可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，如：Hirai等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)HO-1的表達(dá)可以抑制乳腺癌的生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤起抑制作用。有學(xué)者〔10〕發(fā)現(xiàn)HO-1啟動(dòng)子前GT序列的長(zhǎng)短也與癌癥的發(fā)生存在一定聯(lián)系。

人類腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)癌基因和抑癌基因的作用點(diǎn)均是對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。Abraham等〔11〕通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)染的方法觀察了人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中HO-1在細(xì)胞周期進(jìn)程中的作用，結(jié)果表明HO-1表達(dá)增高后CyclinE和CyclinD的表達(dá)上調(diào)，p21、p27、CDK2、CDK5、CDK6表達(dá)下調(diào)。CyclinE是G1期重要的周期蛋白，它與CDK2形成復(fù)合物，促進(jìn)pRB磷酸化，使細(xì)胞通過(guò)限制點(diǎn)，啟動(dòng)S期〔12〕。CyclinE過(guò)表達(dá)將縮短G1期進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，促使細(xì)胞惡化和腫瘤發(fā)生。CyclinE基因的擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)在多種人類腫瘤中體現(xiàn)，它可協(xié)同某些癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞的癌變傾向。p27是1994年發(fā)現(xiàn)的一種分子量為27 kD的熱穩(wěn)定蛋白，它是一種廣譜的CKI分子，可抑制CyclinE-CDK2和CyclinD1-CDK4的活性，阻滯細(xì)胞周期于G1期〔13〕。p27主要抑制CyclinE-CDK2的活性，并且p27與CyclinE-CDK2復(fù)合物之間存在一種相互制約關(guān)系。p27和CDK2結(jié)合后，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期的G1/S期“Checkpoint”對(duì)細(xì)胞周期的發(fā)展起限速作用，控制細(xì)胞增殖和腫瘤形成。

mtHO-1G143H和wtHO-1一樣能夠結(jié)合血紅素，但突變型不能將血紅素分解，因此就造成了一種細(xì)胞內(nèi)血紅素分解產(chǎn)物減少的狀態(tài)，可以利用HO-1活性增高和降低的細(xì)胞模型觀察HO-1的功能是否通過(guò)其分解活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。綜上所述，HO-1活性改變可能與細(xì)胞周期調(diào)控有一定聯(lián)系，HO-1的高表達(dá)有可能會(huì)影響肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖能力，其具體機(jī)制還需深入研究。