張競(jìng)月 金海峰 李燦 金華

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科,吉林 延吉 133000)

他克莫司(TAC)作為一種非常有效的免疫抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于器官移植、自身免疫性疾病、結(jié)締組織病、難治性腎病綜合征的治療，盡管發(fā)現(xiàn)了不少新的免疫抑制劑，TAC仍是實(shí)體器官移植免疫抑制方案的基石。然而，長(zhǎng)期使用TAC會(huì)增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)(如腎毒性、神經(jīng)毒性、感染、惡性腫瘤、糖尿病和胃腸道不適)。眾所周知，吸煙是導(dǎo)致各種癌癥、心血管事件(心肌梗死和腦卒中)和阻塞性肺病的危險(xiǎn)因素。吸煙是一項(xiàng)重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，給社會(huì)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，降低生活質(zhì)量。在腎臟方面，吸煙會(huì)加重糖尿病、高血壓、多囊腎和腎移植術(shù)后患者的腎功能不全程度〔1〕。吸煙還可能導(dǎo)致腎損傷，即使是不存在慢性腎臟病(CKD)的健康人群〔2〕。尼古丁(NIC) 作為煙草中的天然成分，有成癮性及毒性作用，是對(duì)人體產(chǎn)生有害影響的罪魁禍?zhǔn)字?。吸煙是腎臟疾病的一個(gè)重要且可控制的危險(xiǎn)因素，本研究通過(guò)NIC處理TAC誘導(dǎo)的腎損傷大鼠模型，探討NIC加速其腎毒性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 將32只體重為200～220 g的清潔級(jí)雄性SD大鼠(延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)) ，分別置于恒定溫度、濕度、光照控制的環(huán)境中，并允許自由攝入低鹽飲食(0.05%鹽飼料，低鹽飲食增強(qiáng)TAC腎毒性) 和自來(lái)水。適應(yīng)環(huán)境、低鹽飲食和自由飲水后，體重匹配的大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。①正常對(duì)照組(VH組)：皮下注射橄欖油1 ml/(kg·d)。②NIC組：皮下注射橄欖油1 ml/(kg·d)+腹腔注射N(xiāo)IC 1.5 mg/(kg·d)。③TAC組：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg·d)。④TAC+NIC組：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg·d)+ 腹腔注射N(xiāo)IC 1.5 mg/(kg·d)。各組均每日9∶00給藥，共處理4 w后處死大鼠，收集血液、尿液、腎組織標(biāo)本以備進(jìn)一步檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)延邊大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(YBU-2017-045)。

1.2生化檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(ADVIA 120 ，日本拜耳公司)；標(biāo)準(zhǔn)酶比色法測(cè)定血肌酐(Scr) 及血尿素氮(BUN)(Stanbio Lahoratory,Boeme,TX,USA);May-Grun-wald Giemsa 染色法計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞數(shù)，使用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定TAC血藥濃度(TAC con)；尿蛋白排泄量測(cè)定采用酶學(xué)比色法(Modular DPP system,Roche)。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清和尿排泄中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Calbiotech,San Diego,CA) 測(cè)定大鼠血清和尿中的可替寧。

1.3腎臟病理 腎臟組織由過(guò)碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(PLP) 固定，過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色，石蠟包埋后4 μm切片，Masson 三色染色，采用彩色圖像自動(dòng)分析儀(Olympus,日本)高倍鏡視野下分析腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)程度， 每個(gè)標(biāo)本至少觀察 20 個(gè)非重疊腎小管間質(zhì)取平均值。

1.4Western印跡法 腎組織標(biāo)本置于管中，加入蛋白質(zhì)緩沖液(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH7.6；150 mmol/ml氯化鈉，1%脫氧膽酸鈉，1%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1%十二烷基硫酸鈉，1%抑酶肽，2 mmol/L四氧嘧啶，1 ng/ml亮抑酶肽，1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物),室溫勻漿。然后在4℃下，13 000 r/min離心，取上清液，用Bio-Rad蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。取同等量的勻漿在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。在90 V電壓下轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜2 h。浸入5%脫脂奶粉中封閉2 h，在4℃下分別滴加一抗NADPH氧化酶(NOX)-2(1∶500)、NOX-4(1∶500)、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2(1∶500)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1(1∶500)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)(1∶500)、超氧化物歧化酶(SOD)1(1∶500)、 SOD2(1∶500)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3(1∶500)〕，一抗與5%脫脂奶粉混合，緩慢搖擺，4℃下過(guò)夜。TBST反復(fù)洗膜3次，加二抗4 h；TBST反復(fù)沖洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，搖床沖洗10 min。使用電化學(xué)增強(qiáng)(ECL)試劑增強(qiáng)發(fā)光，在暗室下膠片曝光，后采集圖像。使用圖像分析儀(Quantity One) 進(jìn)行Western印跡圖像分析。

1.5原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL) 根據(jù) ApopTag in Situ Apoptosis Detection(Millipore)試劑盒操作步驟測(cè)定細(xì)胞凋亡，200高倍下數(shù)字化顯微鏡分析儀計(jì)數(shù)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA)和 Bonferroni post hoc 校正分析。

2 結(jié) 果

2.1NIC對(duì)基本數(shù)據(jù)及腎功能的影響 與VH組比較，TAC組尿量明顯增加，而NIC+TAC組尿量較TAC組進(jìn)一步增加(P<0.05)；TAC組、NIC組尿蛋白、BUN、Scr水平均明顯升高(P<0.05)，而NIC+TAC組的尿蛋白、BUN、Scr水平較TAC組進(jìn)一步升高(P<0.05)，提示NIC加重TAC誘導(dǎo)的腎功能不全。給藥4 w后，血中TAC濃度增加，而NIC則不影響血TAC濃度，見(jiàn)表1。

表1 各組基本參數(shù)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

2.2NIC對(duì)TAC誘導(dǎo)的腎纖維化及腎小球硬化的影響 TAC組與NIC組腎組織TIF程度明顯增加，NIC+TAC組腎組織TIF程度較TAC組明顯增加，見(jiàn)圖1。Western印跡法結(jié)果顯示，與VH組〔(107.50±15.26)%〕相比，TAC組〔(192.90±17.14)%〕與NIC組〔(189.50±12.58)%〕腎組織中TGF-β1表達(dá)量明顯增加，NIC+TAC組〔(253.20±22.56)%〕腎組織中TGF-β1表達(dá)量較TAC組明顯增加(P<0.05)，提示NIC增強(qiáng)了TAC誘導(dǎo)的促纖維化TGF-β1過(guò)表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖1 各組腎組織TIF程度比較(Masson，×200)

圖2 Western印跡法檢測(cè)各組腎組織TGF-β1的表達(dá)

與VH組〔(1.34±0.58)%〕相比，TAC組與NIC組腎組織PAS染色系膜面積〔(16.23±1.99、14.48±1.56)%〕明顯增加， 而NIC+TAC組的腎組織中PAS染色系膜面積〔(22.24±2.17)%〕較TAC組明顯增加(均P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組腎組織病理形態(tài)學(xué)變化(PAS，×1 000)

2.3NIC對(duì)TAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響 與VH組比較，TAC組與NIC組血清及尿排泄8-OhdG含量均明顯增多(均P<0.05)，NIC+TAC組血清及尿排泄8-OHdG含量較TAC組明顯增多(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組血及尿中8-OHdG水平的比較

與VH組相比，TAC組與NIC組腎組織中SOD1、SOD2表達(dá)降低，NIC+TAC組腎組織中SOD1、SOD2的表達(dá)較TAC組明顯降低。見(jiàn)表3、圖4。TAC組與NIC組腎組織中NOX-2、NOX-4的表達(dá)升高，NIC+TAC組腎組織中NOX-2、NOX-4的表達(dá)較TAC組明顯升高。見(jiàn)表3、圖5。上述分析顯示，NIC上調(diào)了TAC誘導(dǎo)的NOX2和NOX4的表達(dá)，而抑制了SOD1和SOD2的表達(dá)，說(shuō)明在本模型中NIC和TAC對(duì)氧化應(yīng)激有協(xié)同作用。

表3 各組腎組織SOD1、SOD2、NOX-2、NOX-4、Bcl-2/Bax、Cleaved caspase-3的Western印跡表達(dá)量

圖4 各組腎組織中SOD1、SOD2表達(dá)

圖5 各組腎組織NOX-2、NOX-4表達(dá)

2.4NIC對(duì)TAC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 大多數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞或凋亡小體定位于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，尤其是萎縮的腎小管和典型的TIF區(qū)域。與VH組(0.8±0.1)mm2比較，TAC組與NIC組腎組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量〔(9.6±0.8)、(3.8±0.2)〕mm2明顯增加，NIC + TAC組腎組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(13.9±0.4)mm2較TAC組明顯增加。見(jiàn)圖6。Western印跡結(jié)果示，與VH組比較，NIC組與TAC組腎組織中Bcl-2/Bax比值降低，NIC+TAC組腎組織中Bcl-2/Bax比值較TAC組明顯降低。TAC組與NIC組腎組織中活化的Caspase-3升高，NIC + TAC組腎組織中活化的Caspase-3較TAC組明顯升高。見(jiàn)表3、圖7。

圖6 各組腎小管TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(×200)

圖7 各組腎組織中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)

3 討 論

無(wú)論是健康人群，還是有基礎(chǔ)疾病(如高血壓、糖尿病)的患者，吸煙是一個(gè)可控制的引起CKD進(jìn)展的危險(xiǎn)因素〔3〕。研究表明，NIC會(huì)增加腎臟的氧化應(yīng)激，從而損害腎小管和內(nèi)皮細(xì)胞的活力和功能，改變腎臟血流動(dòng)力學(xué)，損害整體腎臟功能〔4〕。此外，NIC增強(qiáng)系膜增生、影響細(xì)胞增殖與凋亡、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)堆積和促進(jìn)腎纖維化途徑來(lái)?yè)p害腎臟功能〔2,5,6〕。臨床試驗(yàn)表明，吸煙可增加尿白蛋白排泄量，對(duì)腎功能產(chǎn)生不利影響，而戒煙可能改善蛋白尿和腎小球?yàn)V過(guò)率，同時(shí)也可能改善CKD和2型糖尿病患者的蛋白尿，并減緩終末期腎衰竭(ESRD)的進(jìn)展〔7～9〕。此外，無(wú)論是移植物受體還是供體，吸煙都會(huì)導(dǎo)致移植排斥反應(yīng)和慢性移植物腎病(CAN)，最終導(dǎo)致腎移植中的移植物丟失〔10,11〕。提示吸煙可能會(huì)加速接受基于TAC的免疫抑制劑的移植腎功能的喪失。

作為有效且具有良好耐受性的臨床免疫抑制劑，TAC的長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多、小動(dòng)脈透明質(zhì)酸沉積、腎小管萎縮、腎小球硬化和腎臟間質(zhì)纖維化，最終產(chǎn)生不可逆的腎臟損傷。本文說(shuō)明NIC導(dǎo)致腎臟損傷，與先前研究一致〔12〕。然而腎毒性模型大鼠用NIC處理后腎功能損傷指標(biāo)進(jìn)一步升高，表明NIC加重TAC誘導(dǎo)的腎損傷。

慢性TAC腎毒性的主要改變?cè)谟谀I小管間質(zhì)區(qū)，如腎小管基底膜增厚、腎小管萎縮和腎小管纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，NIC加重了TAC誘導(dǎo)的部分系膜面積增加和TIF程度。這些病理改變引起更明顯的腎功能損害和尿蛋白排泄的增加。提示吸煙可能加快接受免疫抑制劑治療患者的腎功能損傷。戒煙可能成為延緩或治療腎臟纖維化的重要手段。

慢性TAC腎損傷是多種因素共同導(dǎo)致的結(jié)果，TAC腎損傷與氧化應(yīng)激之間存在密切關(guān)系。氧化應(yīng)激是因?yàn)檠趸€原系統(tǒng)遭到破壞，從而產(chǎn)生大量的活性氧。最近大量研究表明，慢性NIC暴露與腎臟損傷的氧化應(yīng)激之間存在密切關(guān)系〔13,14〕。氧化應(yīng)激在TIF及腎小球系膜硬化、足細(xì)胞異常和頂葉上皮細(xì)胞損傷的腎小球硬化中起著至關(guān)重要的作用〔15〕。8-OHdG作為體內(nèi)DNA氧化損傷分泌最終產(chǎn)物的標(biāo)志物，一般蓄積在腎間質(zhì)和腎小管中，且與機(jī)體氧化損傷程度呈正相關(guān)。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化劑，在維持機(jī)體氧化與抗氧化的平衡中起著至關(guān)重要的作用。它能阻斷自由基導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化生成，保護(hù)其不受自由基的損害〔16〕。近年來(lái)多種不同的腎臟病理模型中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶家族(NOXs) 促進(jìn)腎臟氧化應(yīng)激的發(fā)生。NOX-2和NOX-4是吞噬細(xì)胞中NADPH氧化酶的催化亞基。NOX-2的激活稱為氧化爆發(fā)，促進(jìn)活性氧的生成，導(dǎo)致腎臟損傷。鄭茜子等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，抑制NADPH氧化酶系統(tǒng)可減輕大鼠腎間質(zhì)纖維化。本研究說(shuō)明NIC增加了氧化蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制了抗氧化蛋白的表達(dá)，從而加重了TAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和腎臟纖維化。

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種獨(dú)特形式。該過(guò)程在發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用。TAC誘導(dǎo)的腎損傷與近端腎小管細(xì)胞凋亡有關(guān)。NIC通過(guò)氧化應(yīng)激或激活TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞和腎近端小管細(xì)胞凋亡〔18,19〕。Bcl-2是抑制凋亡基因。Bax是Bcl-2蛋白家族的一員，當(dāng)Bax與線粒體外膜結(jié)合時(shí)會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑，從而改變其通透性并釋放凋亡蛋白。凋亡Bax和抗凋亡Bcl-2蛋白之間的平衡失衡，在啟動(dòng)凋亡途徑的過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用〔20〕。Caspase-3是凋亡細(xì)胞死亡的執(zhí)行者，其激活被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的一種承諾〔21〕。細(xì)胞和組織中Caspase-3活性檢測(cè)是多種凋亡信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要方法。上述研究表明，TAC和NIC均誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而NIC能夠加重TAC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟損傷。

綜上，NIC在TAC慢性腎毒性大鼠模型中加重了TAC誘導(dǎo)的腎損傷。氧化應(yīng)激的加重和程序性細(xì)胞死亡可能是NIC有害作用的一個(gè)潛在機(jī)制。