傅晶依，石曾卉，湯琦龍，劉云，王靜，趙晨皓，趙珺*

(1.長(zhǎng)春大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2.吉林大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；3.榆樹市榆鄉(xiāng)豆制品有限公司，長(zhǎng)春 130400)

大豆(soybean)富含植物蛋白、大豆異黃酮、膳食纖維等多種對(duì)人體有益的成分，其營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值都很高。大豆作為中國(guó)最重要的糧食作物之一，在我國(guó)的生產(chǎn)和消耗量是巨大的。而在大豆加工分離蛋白、豆粉、豆?jié){、豆腐等產(chǎn)品的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——豆渣。豆渣(soybean residue，SR)由于水分含量特別大，極易產(chǎn)生腐敗變質(zhì)等問(wèn)題[1]。目前我國(guó)對(duì)豆渣的處理利用僅限于用作飼料或肥料甚至直接廢棄，造成了極大的資源浪費(fèi)與環(huán)境污染問(wèn)題。

多糖(polysaccharide)廣泛存在于自然界中，是由中性糖與糖醛酸通過(guò)糖苷鍵連接在一起的長(zhǎng)鏈復(fù)雜碳水化合物[2]，作為植物細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)之一，具有抑菌性、抗腫瘤、改善免疫力等生理活性[3-4]，因此在結(jié)構(gòu)和功能上都具有很高的研究?jī)r(jià)值，已成為近些年的研究熱點(diǎn)。研究表明，豆渣中包含大約30%可溶性大豆多糖，并且是酸性多糖[5]。在食品加工中，常被用作穩(wěn)定劑、乳化劑、澄清劑、強(qiáng)化劑、食品特性改善劑等來(lái)提高食品的食用品質(zhì)特性[6]。

現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)多采用熱水浸提、酸堿水解提取、超聲輔助提取等方法從大豆中提取水溶性大豆多糖[7]。本文以豆渣為原料，優(yōu)化超聲輔助提取法與復(fù)合酶解提取法的工藝條件，并對(duì)比兩種提取方法，以期找到提取豆渣中可溶性多糖的最佳方法，為合理利用豆渣、提高大豆利用率提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆渣：由榆樹市榆鄉(xiāng)豆制品有限公司提供；苯酚：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、濃硫酸：分析純，北京化工廠；纖維素酶、酸性蛋白酶：食品級(jí)，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；氨基磺酸、間羥基聯(lián)苯：分析純，范德(北京)生物科技有限公司；三氟乙酸：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器

DZKW-172電熱恒溫水浴鍋 天津天泰儀器有限公司；FA1104N電子天平、3K15高速冷凍離心機(jī) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DZF-6050真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；721型分光光度計(jì) 上海佑科儀器有限公司；LC-10AT高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 工藝流程

1.3.1 超聲輔助提取法工藝流程

一定質(zhì)量干豆渣→加蒸餾水→超聲波→熱水浸提→過(guò)濾去渣→濃縮醇沉→離心干燥→可溶性粗多糖。

1.3.2 復(fù)合酶解提取法工藝流程

一定質(zhì)量干豆渣→加蒸餾水→調(diào)pH至4.0→加入復(fù)合酶(纖維素酶∶蛋白酶為1∶1)→熱水浸提→高溫滅活→過(guò)濾去渣→濃縮醇沉→離心干燥→可溶性粗多糖。

1.4 多糖得率計(jì)算

稱量干燥后所得可溶性粗多糖粉末的質(zhì)量，依據(jù)公式(1)計(jì)算多糖得率。

(1)

1.5 多糖溶解量測(cè)定

取多糖粉末10 mg溶解于1 mL蒸餾水中，振蕩10 min，8000 r/min高速離心10 min后烘干至恒重，依據(jù)公式(2)進(jìn)行計(jì)算。

(2)

1.6 總糖含量與糖醛酸含量測(cè)定

總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法，將多糖樣品配制成0.1 mg/mL多糖溶液，取0.6 mL至試管中，加蒸餾水補(bǔ)足1 mL，向試管中加入0.5 mL 6%的苯酚溶液，2.5 mL濃硫酸，振蕩搖勻靜置反應(yīng)30 min，于490 nm處測(cè)吸光值，重復(fù)3次，計(jì)算樣品中總糖含量。

糖醛酸的測(cè)定采用間羥基聯(lián)苯法，將多糖樣品配制成0.1 mg/mL多糖溶液，取0.4 mL至試管中，加入氨基磺酸40 μL，濃硫酸2.5 mL，振蕩搖勻，沸水浴20 min后迅速用冷水冷卻至室溫，然后加入間羥基聯(lián)苯40 μL，振蕩搖勻，靜置15 min，在525 nm處測(cè)吸光值，重復(fù)3次，計(jì)算樣品中的糖醛酸含量。

1.7 單糖組成測(cè)定

稱取1 mg多糖樣品于酸水解小瓶中，加入1 mL鹽酸-甲醇溶液，充氮?dú)饷芊夂笥?0 ℃反應(yīng)16 h，空氣泵吹干后加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸，在120 ℃下反應(yīng)1 h，反復(fù)加入少量無(wú)水乙醇，水浴蒸發(fā)三氟乙酸。向蒸干后的樣品中加入PMP試劑0.5 mL和0.3 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 mL，振蕩搖勻，取0.1 mL于EP管中，在70 ℃下水浴反應(yīng)30 min后加入超純水50 μL和0.3 mol/L鹽酸溶液50 μL，充分混勻后加入1 mL氯仿，萃取得到剩余的PMP試劑，棄去三氯甲烷層，保留水層，重復(fù)萃取3次，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。

1.8 紫外全波長(zhǎng)掃描分析多糖

將得到的兩種多糖樣品制成0.3 mg/mL的溶液，在200～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全掃描分析，測(cè)定多糖樣品的純度情況。

1.9 多糖紅外光譜分析

分別取兩種不同提取方法得到的豆渣可溶性多糖1 mg，加入180 mg光譜級(jí)溴化鉀，于瑪瑙研缽內(nèi)研磨均勻，壓片至透明后，置于紅外光譜掃描儀在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取法

利用超聲輔助熱水浸提豆渣中可溶性多糖，分別通過(guò)單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察超聲功率、浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響。

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1可知，超聲輔助提取法的最佳單因素條件為超聲功率120 W，浸提時(shí)間4 h，浸提溫度60 ℃，料液比1∶20。超聲波可在介質(zhì)中產(chǎn)生空化、振動(dòng)、破碎等綜合效應(yīng)，通過(guò)打破細(xì)胞壁從而成功提取出天然產(chǎn)物成分。在超聲過(guò)程中，超聲波使多糖分子振蕩而加速溶出，因此當(dāng)超聲功率低于120 W時(shí)，多糖得率隨功率增加而增大。而功率過(guò)大時(shí)，雜質(zhì)的溶出量持續(xù)增加，造成有效成分的比例降低，多糖得率下降[8]；溫度會(huì)加快分子的無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)，加快溶液的擴(kuò)散速度，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的多糖分子由內(nèi)向外傳播，加速多糖分子的溶出。溫度低于60 ℃時(shí)，多糖得率隨溫度升高而增加，但當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃后，多糖得率下降，可能是由于高溫加速多糖分子解離，破壞其結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖得率下降[9]；多糖本身具有一定的擴(kuò)散性、滲透性和溶解性，當(dāng)提取時(shí)間低于4 h時(shí)，隨著時(shí)間的增加，溶出的多糖增多，得率上升。但是當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)4 h后，因?yàn)槎嗵堑臄U(kuò)散達(dá)到平衡，繼續(xù)浸提會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)等成分溶出，降低多糖的比例，使得率出現(xiàn)下降趨勢(shì)；料液比高于1∶20時(shí)，多糖得率隨料液比降低而增加，此時(shí)豆渣浸沒不完全，有效成分不能充分溶出[10]。但當(dāng)料液比低于1∶20時(shí)，多糖類物質(zhì)的比例降低，多糖得率下降。

圖1 超聲功率、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power, extraction temperature, extraction time, solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides

2.1.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行四因素三水平L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)，其因素及水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 超聲輔助提取法正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal array design for ultrasonic-assisted extraction method

表2 超聲輔助提取法正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results for ultrasonic-assisted extraction method

由表2可知，影響多糖得率的各因素主次關(guān)系為：超聲功率(C)>料液比(D)>浸提時(shí)間(B)>浸提溫度(A)；且最佳工藝條件A3B1C3D2，即浸提溫度70 ℃、浸提時(shí)間3 h、超聲功率140 W、料液比1∶20，此條件下多糖得率為6.13%。

2.2 復(fù)合酶解提取法

利用纖維素酶與酸性蛋白酶以1∶1的比例復(fù)配進(jìn)行酶解提取豆渣中可溶性多糖，分別通過(guò)單因素與正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察酶添加量、浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比對(duì)多糖得率的影響。

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖2可知，復(fù)合酶解提取法的最佳單因素條件為浸提時(shí)間1.5 h，酶添加量2%，浸提溫度50 ℃，料液比1∶25。復(fù)合酶解提取法下的浸提時(shí)間和料液比對(duì)多糖得率的影響趨勢(shì)基本與超聲輔助提取法相同，但最佳浸提時(shí)間縮短至1.5 h，最佳料液比降低至1∶25；纖維素酶能夠破壞細(xì)胞的細(xì)胞壁，促進(jìn)多糖在溶劑中擴(kuò)散，提高多糖得率。當(dāng)酶添加量低于2%時(shí)，多糖得率隨加酶量的增加而升高，這可能是由于酶添加量的增加使酶與底物接觸的機(jī)會(huì)增加，有利于多糖溶出[11]。但酶的添加量過(guò)高時(shí)，各組分會(huì)在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)相互抑制反應(yīng)，導(dǎo)致多糖得率下降；溫度會(huì)加快分子的無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)，有助于多糖分子向細(xì)胞外擴(kuò)散。溫度低于50 ℃時(shí)，多糖得率隨溫度升高而增加，在50 ℃時(shí)達(dá)到峰值，溫度超過(guò)50 ℃時(shí)得率下降，可能是因?yàn)槊傅淖钸m溫度為50 ℃，溫度過(guò)高會(huì)降低酶活，細(xì)胞壁分解不完全，降低了多糖溶出量，導(dǎo)致得率下降。

圖2 酶添加量、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effects of enzyme additive amount, extraction temperature, extraction time and solid-to-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides

2.2.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行四因素三水平L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)，其因素及水平見表3，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表3 復(fù)合酶解提取法正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal array design for compound enzymatic extraction method

表4 復(fù)合酶解提取法正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 4 Analysis of orthogonal test results of compound enzymatic extraction method

由表4可知，影響多糖得率的各因素主次關(guān)系為：酶添加量(D)>料液比(C)>浸提時(shí)間(A)>浸提溫度(B)；且最佳工藝條件A1B3C3D3，即復(fù)合酶添加量2.5%、浸提溫度60 ℃、浸提時(shí)間1 h、料液比1∶30，此條件下多糖得率為7.72%。

2.3 多糖形態(tài)特性對(duì)比

兩種提取方法得到的多糖研磨成粉末后的形態(tài)對(duì)比圖見圖3。

圖3 豆渣中可溶性多糖形態(tài)特性對(duì)比圖Fig.3 The comparison diagrams of morphological characteristics of soluble polysaccharides in soybean residues注：A為超聲輔助提取法得到的可溶性多糖；B為復(fù)合酶解提取法得到的可溶性多糖。

超聲輔助提取法得到的多糖粉末顆粒較小，質(zhì)地細(xì)密。復(fù)合酶解提取法得到的多糖粉末顆粒較大，質(zhì)地粗糙，且研磨更加困難。這可能是由于超聲的空化作用更有效地破壞了多糖的鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)[12]，使多糖分子量變小，所以相比復(fù)合酶解提取法得到的多糖呈現(xiàn)出粉末顆粒較小、質(zhì)地細(xì)密的特點(diǎn)。

2.4 多糖溶解量測(cè)定

由表5可知，超聲輔助提取法得到的豆渣中可溶性多糖的最大溶解量為5.1 mg/mL；復(fù)合酶解提取法的最大溶解量為4.2 mg/mL。超聲波使多糖分子的羥基暴露更充分，親水性更好，且超聲波的空化作用使提取出來(lái)的多糖分子相比復(fù)合酶解提取得到的多糖分子的粒徑更小，使得超聲輔助提取法得到的多糖具有更高的溶解性。

表5 豆渣中可溶性多糖溶解量Table 5 The dissolution amount of soluble polysaccharides in soybean residues

2.5 總糖含量與糖醛酸含量分析

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)，490 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，得到的回歸方程為y=0.0102x+0.0243，R2=0.9979。將兩種多糖樣品在490 nm處的吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程中，經(jīng)計(jì)算得到超聲輔助提取法所得多糖總糖含量為83.28%，復(fù)合酶解提取法所得多糖的總糖含量為91.78%。

以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以半乳糖醛酸的濃度為橫坐標(biāo)，525 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，得到的回歸方程為y=0.014x+0.0217，R2=0.9952。將兩種多糖樣品在525 nm處的吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程中，經(jīng)計(jì)算得到超聲輔助提取法所得多糖的糖醛酸含量為4.34%，復(fù)合酶解提取法所得多糖的糖醛酸含量為7.02%。

經(jīng)過(guò)化學(xué)組成分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶解提取法所得多糖的總糖含量與糖醛酸含量均高于超聲輔助提取法，多糖雜質(zhì)少，酸性糖含量增加，可能是由于復(fù)合酶破壞了細(xì)胞壁，釋放出半乳糖醛酸。

2.6 單糖組成分析

進(jìn)一步通過(guò)HPLC測(cè)定兩種不同提取方法所得多糖的單糖組成，以9種單糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，結(jié)果見表6。超聲輔助提取法所得多糖中的主要單糖組分間物質(zhì)的摩爾比是Gal∶Ara∶Glc∶Man為10.2∶2.4∶60.9∶26.4；復(fù)合酶解提取法所得多糖中的主要單糖組分間物質(zhì)的摩爾比是Gal∶Ara∶Glc∶Man∶GalA為11.1∶5.9∶56.3∶21.3∶5.3。通過(guò)分析單糖組成可知，兩種多糖的單糖組成基本一致，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，但酶解的糖中含有少量的半乳糖醛酸(GalA)，可能是由于復(fù)合酶的參與使細(xì)胞壁降解得更加徹底。

表6 兩種提取方法所得多糖的單糖組成Table 6 The monosaccharide composition of polysaccharides obtained by two extraction methods

2.7 紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果

超聲輔助提取法與復(fù)合酶解提取法所得多糖的紫外可見光譜檢測(cè)結(jié)果見圖4。

圖4 兩種提取方法所得多糖的UV-VIS吸收?qǐng)D譜Fig.4 UV-VIS absorption spectra of polysaccharides obtained by two extraction methods

由圖4可知，兩種多糖在280 nm處顯示色氨酸特征吸收峰，表明兩種多糖中均有蛋白的存在，但280 nm處峰面積較小，說(shuō)明蛋白含量極低，多糖純度較高[13]。

2.8 多糖紅外光譜分析

兩種提取方法得到的豆渣中可溶性多糖的紅外測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 可溶性多糖的紅外譜圖Fig.5 The infrared spectra of soluble polysaccharides

兩種多糖在3404，2926，1653，1409，1152，1016 cm-1附近處有較強(qiáng)的吸收峰。其中在3404 cm-1附近處出現(xiàn)的吸收峰峰形較寬，為多糖-OH的伸縮振動(dòng)。在2926 cm-1附近處的吸收峰為多糖的C-H伸縮振動(dòng)。在1653 cm-1附近處的吸收峰為多糖的羰基O-C-O非對(duì)稱振動(dòng)。在1409 cm-1附近處的吸收峰由半乳聚糖骨架上的C-H振動(dòng)產(chǎn)生。在1152 cm-1附近處的吸收峰由半乳糖共振產(chǎn)生，而在1016 cm-1附近處的吸收峰則表明該種多糖是吡喃型多糖。通過(guò)對(duì)以上官能團(tuán)數(shù)據(jù)分析可知，超聲輔助提取法和復(fù)合酶解提取法得到的多糖均具有多糖類物質(zhì)的一般特征吸收峰[14-15]，且對(duì)比兩種多糖的紅外譜圖發(fā)現(xiàn)，兩種提取方法均未破壞或者改變多糖的特征官能團(tuán)，因此推斷多糖的活性沒有被改變。

2.9 兩種提取方法總結(jié)比較

由表7可知，復(fù)合酶解提取法相比超聲輔助提取法提取時(shí)間更短，提取溫度低，用較少的豆渣且只需要添加少量的酶，便可以提高豆渣中可溶性多糖的得率。而超聲輔助提取法得到的豆渣中可溶性多糖比復(fù)合酶解提取法的溶解性好，粉末顆粒較小，質(zhì)地細(xì)密。

表7 兩種提取方法的最佳提取工藝和結(jié)果比較Table 7 The comparison of the optimal extraction technology and results of the two extraction methods

3 結(jié)論

超聲輔助提取法影響豆渣中的水溶性大豆多糖得率的最主要因素是超聲功率，且最佳工藝條件為超聲功率140 W、浸提溫度70 ℃、浸提時(shí)間3 h、料液比1∶20，此條件下豆渣中可溶性多糖得率為6.13%。復(fù)合酶解提取法的最主要因素是酶添加量，且最佳工藝條件為酶添加量2.5%、浸提溫度60 ℃、浸提時(shí)間1 h、料液比1∶30，此條件下豆渣中可溶性多糖得率為7.72%。

以上兩種提取方法相比傳統(tǒng)的熱水浸提法，都具有快速、高效、節(jié)省能源、避免浪費(fèi)等特點(diǎn)。且由紅外分析可知，兩種提取方法均未改變多糖的特征官能團(tuán)，對(duì)多糖活性沒有影響。雖然超聲輔助提取法相比復(fù)合酶解提取法得到的多糖粉末質(zhì)地更細(xì)密，溶解性更好，但考慮到實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)該滿足易操作、節(jié)能、省時(shí)和降低成本的特點(diǎn)，所以復(fù)合酶解提取法更易在生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)。為了增強(qiáng)豆渣中可溶性多糖的利用效果，未來(lái)可以考慮在復(fù)合酶解提取法的基礎(chǔ)上加以超聲輔助，提高多糖溶解性，以此促進(jìn)豆渣的綜合利用和大豆工業(yè)的發(fā)展，這也將是我們接下來(lái)進(jìn)一步探討的方向。