祁百巍，陳煉紅

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

當(dāng)前食品添加劑中使用大量的食用紅色素，可分為天然紅色素和人工合成紅色素兩大類(lèi)。合成色素具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、堅(jiān)牢度大、性質(zhì)穩(wěn)定、成本較低等優(yōu)點(diǎn)[1]。但絕大多數(shù)合成色素對(duì)人體有害，安全性低。而天然色素主要是從動(dòng)物、植物和微生物中提取的，對(duì)人體的安全性較高[2]。不僅如此，天然色素含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及對(duì)人體有益的功能性活性成分,具有抗菌消炎、抗氧化、降血脂等功能[3]。因此，食用天然色素的研究有著廣闊的發(fā)展前景。

紅藍(lán)草，又名紅絲線(xiàn)，屬爵床科植物，是桂西染色植物之一，主要分布于我國(guó)云南、廣東、廣西、貴州等地[4]。紅藍(lán)草紅色素含有黃酮、生物堿等成分，具有保護(hù)肝臟、降壓、鎮(zhèn)咳等功效[5]?，F(xiàn)已應(yīng)用于五彩糯米飯、紅蘭酒等廣西特色食品中，可見(jiàn)紅藍(lán)草紅色素是很好的天然食用色素來(lái)源。目前國(guó)內(nèi)對(duì)紅藍(lán)草的研究多見(jiàn)于成分分析和藥理活性研究，而對(duì)紅藍(lán)草紅色素提取工藝優(yōu)化和其穩(wěn)定性與抗氧化活性的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)基于傳統(tǒng)的水浸提法，輔以超聲、微波，篩選最佳提取方法并優(yōu)化其工藝條件，以及色素在不同條件下的穩(wěn)定性和抗氧化活性，為紅藍(lán)草紅色素的生產(chǎn)及在食品行業(yè)中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅藍(lán)草：購(gòu)自廣西來(lái)賓忻城縣(去桿取葉，洗凈，恒溫干燥60 ℃，粉碎，備用)；無(wú)水乙醇、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鋁、氯化銅、氯化鉀、抗壞血酸、山梨酸鉀、磷酸氫鉀、鄰苯三酚、水楊酸、DPPH、過(guò)氧化氫、Tris-HCl、硫酸亞鐵：分析純，成都市科龍化工試劑廠；D101大孔樹(shù)脂：分析純，成都市怡語(yǔ)化學(xué)試劑經(jīng)營(yíng)部。

DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；UV-6100紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；5804R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；G8023EHL-V8微波爐 廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

1.2.1.1 紅藍(lán)草紅色素提取

紅藍(lán)草葉→清洗→烘干→粉碎→提取→離心→收集上清液→紅藍(lán)草紅色素提取液→純化→紅藍(lán)草紅色素純化液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→紅藍(lán)草紅色素濃縮液。

1.2.1.2 操作要點(diǎn)

將紅藍(lán)草葉洗凈瀝干，置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥6 h，粉碎過(guò)80目篩密封，置于冰箱保鮮層備用。稱(chēng)取2 g的紅藍(lán)草粉末于錐形瓶中，按料液比1∶20 (g/mL)加入超純水，搖勻，進(jìn)行提取，將粗提液倒入50 mL試管中，經(jīng)6000 r/min離心10 min后，吸取上清液，稀釋20倍，測(cè)定在490 nm處的吸光值[6]。將上清液過(guò)D101大孔樹(shù)脂柱，吸附12 h后，分別用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液洗脫，并將紅黃色部分進(jìn)行收集，于80 ℃下蒸發(fā)4～5 h得到紅藍(lán)草紅色素濃縮液，密封置于冰箱中備用。

1.2.2 紅藍(lán)草紅色素3種提取方法比較

水浴浸提法：稱(chēng)取3份紅藍(lán)草粉2 g，置于錐形瓶中并做好標(biāo)記，料液比1∶20 (g/mL)加入超純水，搖勻后將其置于50 ℃的恒溫水浴鍋中1 h。將粗提液離心，吸取上清液并將其稀釋20倍后測(cè)定吸光度值。

準(zhǔn)確稱(chēng)取3份紅藍(lán)草粉2 g，按料液比1∶20 (g/mL)加入超純水，搖勻后將其分別置于恒溫水浴鍋、超聲波清洗儀、微波爐中進(jìn)行提取。超聲波清洗儀功率設(shè)置為200 W，超聲波清洗儀與恒溫水浴鍋溫度均設(shè)置為50 ℃，超聲時(shí)間與水浴時(shí)間均為1 h，微波功率設(shè)置為280 W，微波時(shí)間為80 s。提取結(jié)束，將粗提液離心，吸取上清液并將其稀釋20倍后測(cè)定吸光度值。

1.2.3 紅藍(lán)草紅色素提取的單因素試驗(yàn)

由1.2.2確定紅藍(lán)草紅色素的提取方法，參照上述操作要點(diǎn)，準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g紅藍(lán)草粉末，以吸光值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)、不同溫度(40，50，60，70，80 ℃)、不同超聲時(shí)間(30，60，90，120 min)以及不同超聲功率(60，120，180 W)對(duì)吸光值的影響。

1.2.4 紅藍(lán)草紅色素提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲功率(D)為自變量，以吸光值為響應(yīng)值，采用L9(34)響應(yīng)面分析法，優(yōu)化紅藍(lán)草紅色素提取工藝。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得到最佳優(yōu)化條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)出吸光度，進(jìn)行分析比較。

1.2.6 紅藍(lán)草紅色素穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取2.5 mL色素提取液，用不同溶液定容到50 mL，以吸光值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察靜置3 h后不同pH(2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)、不同溫度(20，40，60，80，100 ℃)和分別靜置1，2，3 h后不同食鹽濃度(0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%)、不同蔗糖濃度(0.5%、1%、3%、5%、10%)、不同還原劑濃度(0.1%、0.5%、1%)、不同防腐劑濃度(0.1%、0.3%、0.5%)及不同金屬離子(Mg2+、Ca2+、Al3+、Cu2+、K+)條件下對(duì)吸光值的影響。

1.2.7 紅藍(lán)草紅色素的抗氧化活性試驗(yàn)

運(yùn)用體外抗氧化活性研究，測(cè)定紅藍(lán)草紅色素對(duì)·OH、O2-·及DPPH·的清除能力，并在一定條件下與抗壞血酸作對(duì)比來(lái)評(píng)價(jià)紅藍(lán)草紅色素的抗氧化活性。

1.2.7.1 紅藍(lán)草紅色素對(duì)·OH清除能力的測(cè)定

用超純水將紅藍(lán)草紅色素濃縮液稀釋為10，20，30，40 mg/mL的色素溶液，并配制相同濃度的抗壞血酸溶液[7]，分別取9份1 mL 9 mmol/L FeSO4，1 mL 9 mmol/L水楊酸加入到試管中，搖勻，分別加入2 mL不同濃度的紅藍(lán)草紅色素溶液及抗壞血酸溶液，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，振蕩搖勻后避光靜置30 min，測(cè)定510 nm處吸光值，并使用蒸餾水取代色素溶液作空白組,以蒸餾水代替H2O2作對(duì)照組。

式中：A0為空白組的吸光度；Ax為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；Ax0為對(duì)照組的吸光度。

1.2.7.2 紅藍(lán)草紅色素對(duì)O2-·清除能力的測(cè)定

取9份4.5 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)，放入試管中， 25 ℃預(yù)熱20 min后分別加入1 mL不同濃度的色素溶液及抗壞血酸溶液，再加入0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴反應(yīng)5 min，立即測(cè)定420 nm處吸光值，用蒸餾水取代色素溶液作空白組。

式中：A0為空白組的吸光度；Ax為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；Ax0為對(duì)照組的吸光度。

1.2.7.3 紅藍(lán)草紅色素對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定

取2 mL不同濃度的色素溶液及抗壞血酸溶液，分別加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液(無(wú)水乙醇配制)，避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度，并使用蒸餾水取代色素溶液作空白組,以無(wú)水乙醇代替DPPH·自由基作對(duì)照組。

式中：A0為空白組的吸光度；Ax為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；Ax0為對(duì)照組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的確定

以490 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值為指標(biāo)，3種方法的提取效果見(jiàn)圖1。

圖1 不同提取方法對(duì)紅藍(lán)草紅色素吸光度值的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

由圖1可知，3種提取方法對(duì)紅藍(lán)草紅色素的提取效果：超聲波輔助水提法>水浴浸提法>微波輔助水提法。超聲波輔助水提法主要利用超聲波的空化效應(yīng)加速植物有效成分的溶出，另外，其次級(jí)效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎等也能加速目標(biāo)物質(zhì)的擴(kuò)散釋放，并充分與溶劑混合，提高提取效率。因此，在相同的溫度下，單位時(shí)間內(nèi)超聲波輔助水提法比常規(guī)的水浴水提法的提取效果更佳。微波輔助水提法主要利用物質(zhì)在微波場(chǎng)中吸收微波能力的差異使提取體系中某些區(qū)域或某些組分被選擇性加熱，從而使得目標(biāo)物質(zhì)從基體和體系中分離[8]。然而，運(yùn)用微波輔助水提法提取紅藍(lán)草紅色素的效果不佳，且比常規(guī)的水浴水提法要差，可能的原因是經(jīng)微波處理產(chǎn)生的高溫對(duì)色素物質(zhì)造成破壞[9]。綜合考慮，確定以超聲波輔助水提法作為提取紅藍(lán)草紅色素的最優(yōu)方法，并運(yùn)用響應(yīng)面分析法確定此方法的最佳提取工藝參數(shù)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同料液比對(duì)紅藍(lán)草紅色素提取效果的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，色素提取液的吸光值呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在1∶20時(shí)達(dá)到峰值。隨后，提取溶劑用量增加，色素提取量下降，但下降幅度不大，曲線(xiàn)趨于平穩(wěn)，原因可能是隨著料液比的增加，紅藍(lán)草與提取溶劑的接觸面增加，色素類(lèi)物質(zhì)向溶劑溶出的阻力減小，使得提取液中溶解的色素含量增加；當(dāng)料液比達(dá)到一定值時(shí)，色素中的有效成分基本溶出，傳質(zhì)推動(dòng)力減小，提取量有所降低[10]。

圖2 不同料液比對(duì)紅藍(lán)草紅色素吸光度值的影響Fig.2 Effects of different solid-liquid ratios on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

2.2.2 不同超聲溫度對(duì)紅藍(lán)草紅色素提取效果的影響

溫度對(duì)植物成分的提取影響很大[11]。由圖3可知，當(dāng)超聲溫度低于50 ℃時(shí)，色素提取液的吸光度隨溫度增加而緩慢上升，并于50 ℃時(shí)達(dá)到頂峰，當(dāng)超聲溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，色素提取液的吸光度急劇下滑，說(shuō)明溫度過(guò)低不利于色素的溶出，適當(dāng)提高溫度可加速分子的運(yùn)動(dòng)從而促進(jìn)色素溶進(jìn)溶劑，但過(guò)高的溫度易對(duì)色素或細(xì)胞組織造成破壞，從而使吸光度降低。因此，通過(guò)超聲溫度單因素試驗(yàn)可知，將超聲溫度設(shè)置為50 ℃，紅藍(lán)草紅色素的提取效果最佳。

圖3 不同超聲溫度對(duì)紅藍(lán)草紅色素吸光度值的影響Fig.3 Effects of different ultrasonic temperatures on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

2.2.3 不同超聲時(shí)間對(duì)紅藍(lán)草紅色素提取效果的影響

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，色素含量上升，當(dāng)超聲時(shí)間為120 min時(shí)，色素提取液的吸光度達(dá)最高值，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，色素含量下降明顯。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)某暡ㄗ饔脮r(shí)間，可利用其空化作用增加色素與試劑的接觸面積，提高色素溶解程度；過(guò)長(zhǎng)的超聲作用時(shí)間，可能會(huì)導(dǎo)致色素結(jié)構(gòu)被破壞，不利于色素提取[12]。

圖4 不同超聲時(shí)間對(duì)紅藍(lán)草紅色素吸光度值的影響Fig.4 Effects of different ultrasonic time on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

續(xù) 表

2.2.4 不同超聲功率對(duì)紅藍(lán)草紅色素提取效果的影響

由圖5可知，在不同的超聲功率下，色素提取液的吸光度隨功率的加大先增加后減小，當(dāng)超聲功率在120 W時(shí)紅藍(lán)草紅色素提取液的吸光度達(dá)到最大值。其原因可能是隨著超聲功率的提高，超聲的空化作用增強(qiáng)，溶劑更易滲入細(xì)胞中，提高紅藍(lán)草紅色素的溶出[13]。當(dāng)超聲功率大于120 W時(shí)，超聲波空化作用的加強(qiáng)可能會(huì)破壞色素的結(jié)構(gòu)，不利于色素提取。因此，通過(guò)超聲功率單因素試驗(yàn)可知，最佳超聲功率為120 W。

圖5 超聲功率對(duì)紅藍(lán)草紅色素吸光度值的影響Fig.5 Effects of different ultrasonic power on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

由Design-Expert軟件分析上述4個(gè)因素后設(shè)計(jì)出29組試驗(yàn)方案，試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，響應(yīng)面模型的方差分析和顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。

表2 Box-Benhnken設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Benhnken design and experimental results

表3 響應(yīng)面模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted response surface model

由表3可知，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立的回歸方程模型P<0.0001，模型差異極顯著。失擬項(xiàng)P=0.5702>0.05，表明該模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合充分。利用該模型可較好地描述各試驗(yàn)因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系，并且可以?xún)?yōu)化紅藍(lán)草紅色素的最佳工藝條件?；貧w方程為：Y=-0.41+0.085A+0.045B+0.013C+6.442E-003D-0.015AB-0.015AC+0.025AD-0.068BC+0.024BD-0.014CD-0.011A2-0.12B2-0.041C2-0.036D2。

依據(jù)F值大小可以判斷各試驗(yàn)因素對(duì)提取的影響程度，F(xiàn)值越大，表明該試驗(yàn)因素對(duì)提取效果的影響越顯著。F(A)=72.84、F(B)=20.87、F(C)=1.85、F(D)=0.42，即各試驗(yàn)對(duì)紅藍(lán)草紅色素含量影響大小為料液比>超聲溫度>超聲時(shí)間>超聲功率，并且料液比和超聲溫度對(duì)紅藍(lán)草紅色素的影響達(dá)到了極顯著水平。

2.3.2 交互作用的結(jié)果分析

采用響應(yīng)面的坡度陡峭程度來(lái)衡量試驗(yàn)因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響強(qiáng)弱，響應(yīng)曲面相對(duì)平緩，說(shuō)明該因素交互作用對(duì)紅藍(lán)草紅色素含量影響作用較小[14]。各試驗(yàn)因素交互作用對(duì)紅藍(lán)草紅色素含量的影響見(jiàn)圖6～圖11。

圖6 料液比和超聲溫度對(duì)吸光度值影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.6 Response surface and contour plot for the effects of solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

圖7 料液比和超聲時(shí)間對(duì)吸光度值影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.7 Response surface and contour plot for the effects of solid-liquid ratio and ultrasonic time on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

圖8 料液比和超聲功率對(duì)吸光度值影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.8 Response surface and contour plot for the effects of solid-liquid ratio and ultrasonic power on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

圖9 超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)吸光度值影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.9 Response surface and contour plot for the effects of ultrasonic temperature and ultrasonic time on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

圖10 超聲溫度和超聲功率對(duì)吸光度值影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.10 Response surface and contour plot for the effects of ultrasonic temperature and ultrasonic power on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

圖11 超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)吸光度值影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.11 Response surface and contour plot for the effects of ultrasonic time and ultrasonic power on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

從響應(yīng)面圖中可直觀地看出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)面圖和表3的擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析表明， A，B對(duì)紅藍(lán)草紅色素提取的影響極顯著，二次項(xiàng)B2、C2的影響極顯著，D2的影響顯著，交互項(xiàng)BC的影響極顯著。各因素交互作用對(duì)紅藍(lán)草紅色素含量影響順序?yàn)锽C>AD>BD>AB>AC>CD。

2.3.3 最佳工藝平行驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)得到的模型預(yù)測(cè)紅藍(lán)草紅色素的最佳提取工藝為料液比1∶25，超聲溫度53.05 ℃，超聲時(shí)間108.54 min，超聲功率157.10 W，在此提取條件下響應(yīng)值最大，為0.421338。為便于實(shí)際操作，將工藝調(diào)整為：料液比1∶25，超聲溫度53 ℃，超聲時(shí)間109 min，超聲功率160 W。在上法條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，吸光值分別為0.429，0.418，0.422，均與響應(yīng)面預(yù)測(cè)最優(yōu)結(jié)果0.421338相差很小，因此用響應(yīng)面法對(duì)紅藍(lán)草紅色素的超聲波輔助水提工藝的優(yōu)化效果良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 不同pH對(duì)紅藍(lán)草紅色素穩(wěn)定性的影響

由表4可知，在pH為2～9范圍內(nèi)，吸光度隨pH的增大而降低。其中在pH為5～7時(shí)，色素相對(duì)穩(wěn)定；在低酸性環(huán)境下，吸光度較高，說(shuō)明紅藍(lán)草紅色素在酸性環(huán)境中具有較好的耐受性；在堿性條件下，吸光度銳減，說(shuō)明其耐堿性差。綜合來(lái)看，紅藍(lán)草紅色素能應(yīng)用于酸性到中性食品的著色，尤其是果汁、糖果等，且具有良好的穩(wěn)定性。

表4 不同pH環(huán)境下紅藍(lán)草紅色素吸光度的變化Table 4 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different pH values

2.4.2 不同溫度對(duì)紅藍(lán)草紅色素穩(wěn)定性的影響

由表5可知，色素在20～100 ℃之間基本穩(wěn)定，說(shuō)明紅藍(lán)草紅色素能在加熱情況下穩(wěn)定存在，具有較高的熱穩(wěn)定性，一般高溫不易造成損失，適用于一般熱加工食品。

表5 不同溫度環(huán)境下紅藍(lán)草紅色素吸光度的變化Table 5 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different temperatures

2.4.3 食鹽對(duì)紅藍(lán)草紅色素穩(wěn)定性的影響

由表6可知，紅藍(lán)草紅色素在濃度為0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%食鹽溶液中吸光度的變化不大，且延長(zhǎng)靜置時(shí)間，其吸光度變化幅度不大。因此，紅藍(lán)草紅色素對(duì)食鹽具有較高的耐受性。

表6 不同濃度的食鹽溶液及靜置時(shí)間下紅藍(lán)草紅色素吸光度的變化Table 6 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different salt concentration and standing time

2.4.4 蔗糖對(duì)紅藍(lán)草紅色素穩(wěn)定性的影響

由表7可知，隨著蔗糖溶液濃度上升，吸光度值呈上升趨勢(shì)。隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，紅藍(lán)草紅色素于0.5%、1%、10%的蔗糖溶液中吸光度值有所增加，這表明蔗糖對(duì)紅藍(lán)草紅色素具有明顯的增色作用，且色素具有高的耐糖性，適用于糖漬食品的生產(chǎn)加工。

表7 不同濃度的蔗糖溶液及靜置時(shí)間下紅藍(lán)草紅色素吸光度的變化Table 7 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different sucrose concentration and standing time

2.4.5 還原劑對(duì)紅藍(lán)草紅色素穩(wěn)定性的影響

由表8可知，同一濃度，隨著靜置時(shí)間延長(zhǎng)，吸光值變化不大。相同時(shí)間內(nèi)，抗壞血酸濃度越高，色素吸光值越大。說(shuō)明還原劑對(duì)紅藍(lán)草紅色素具有良好的增色作用。

表8 不同濃度抗壞血酸溶液及靜置時(shí)間下紅藍(lán)草紅色素吸光度的變化Table 8 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different ascorbic acid concentration and standing time

2.4.6 食品防腐劑對(duì)紅藍(lán)草紅色素穩(wěn)定性影響

由表9可知，隨著山梨酸鉀濃度的增加以及靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光值穩(wěn)定在0.550左右，說(shuō)明食品防腐劑對(duì)紅藍(lán)草紅色素穩(wěn)定性的干擾較小，適用于大部分主要以山梨酸鉀作為食品防腐劑的包裝食品。

表9 不同濃度山梨酸鉀溶液及靜置時(shí)間下紅藍(lán)草紅色素吸光度的變化Table 9 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different potassium sorbate concentration and standing time

2.4.7 金屬離子對(duì)紅藍(lán)草紅色素穩(wěn)定性的影響

由表10可知，在Mg2+、Ca2+、K+溶液中，隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光值變化不明顯，說(shuō)明這3種金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響較?。欢诮饘黉X離子溶液中，吸光值明顯高于其他種類(lèi)金屬離子溶液，且隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光值增加，說(shuō)明其能保護(hù)紅藍(lán)草紅色素，且存在增色作用；但在Cu2+溶液中吸光值比其他金屬離子溶液低，且隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光值下降。結(jié)果表明，金屬銅易使紅藍(lán)草紅色素發(fā)生降解，在貯存或加工過(guò)程中應(yīng)避免與銅器接觸。

表10 不同金屬離子及靜置時(shí)間下紅藍(lán)草紅色素吸光度的變化Table 10 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different metal ions and standing time

2.5 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 紅藍(lán)草紅色素對(duì)O2-·清除能力

由圖12可知，反應(yīng)體系中，超氧陰離子隨紅藍(lán)草紅色素濃度的增加不減反增。經(jīng)過(guò)分析與討論，造成此現(xiàn)象的原因可能是：由于僅經(jīng)過(guò)粗純化，紅藍(lán)草色素提取物中可能含有與鄰苯三酚結(jié)構(gòu)相似的能夠產(chǎn)生超氧陰離子的物質(zhì)，但由于色素溶液中可清除O2-·物質(zhì)的有效濃度較低，對(duì)O2-·的清除速度小于其產(chǎn)生速度，所以出現(xiàn)紅藍(lán)草紅色素對(duì)O2-·的清除能力呈負(fù)增長(zhǎng)的現(xiàn)象，而其他可能性有待深入探究。

圖12 紅藍(lán)草紅色素對(duì)O2-·的清除能力Fig.12 The scavenging ability of red pigment from Eccoilopus cotulifer on O2-·

2.5.2 紅藍(lán)草紅色素對(duì)·OH清除能力

由圖13可知，紅藍(lán)草紅色素對(duì)·OH具有一定的清除效果，濃度越高，對(duì)·OH的清除率越大，且清除率的增長(zhǎng)速度越迅速。但是從圖中可看出，相同濃度的抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除率高于紅藍(lán)草紅色素，且在40 mg/mL時(shí)清除率已高達(dá)99.78%。結(jié)果表明，紅藍(lán)草紅色素能高效去除羥自由基且濃度越高清除率越大，但效果低于同樣濃度下的抗壞血酸。

圖13 紅藍(lán)草紅色素對(duì)·OH的清除能力Fig.13 The scavenging ability of red pigment from Eccoilopus cotulifer on ·OH

2.5.3 紅藍(lán)草紅色素對(duì)DPPH·的清除能力

由圖14可知，在濃度為10 mg/mL時(shí)，抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率已高達(dá)93.50%，之后隨著濃度的增大，基本無(wú)變化。而紅藍(lán)草紅色素對(duì)DPPH·的清除率隨著濃度的增大而增加，并呈一定比例。結(jié)果表明，紅藍(lán)草紅色素對(duì)DPPH·具有一定的清除能力，但其清除效果較相同濃度的抗壞血酸弱。

圖14 紅藍(lán)草紅色素對(duì)DPPH·的清除能力Fig.14 The scavenging ability of red pigment from Eccoilopus cotulifer on DPPH·

3 結(jié)論

通過(guò)方法篩選試驗(yàn)確定最佳提取方法是超聲波輔助水提法，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法展開(kāi)四因素三水平試驗(yàn)，得到紅藍(lán)草紅色素的最佳提取參數(shù)為：料液比1∶25 (g/mL)，超聲溫度53 ℃，超聲時(shí)間109 min，超聲功率160 W。

穩(wěn)定性試驗(yàn)表明：紅藍(lán)草紅色素有良好的耐熱性、耐酸性，能夠在食鹽溶液和蔗糖溶液及含山梨酸鉀的體系中穩(wěn)定地存在，但在堿性環(huán)境中耐受性較差，紅藍(lán)草紅色素對(duì)大部分金屬離子具有穩(wěn)定性，其中Al3+對(duì)其起增色作用，另外，其在還原劑存在的條件下，還原劑濃度的升高與放置時(shí)間的延長(zhǎng)都能使穩(wěn)定性有所加強(qiáng)。

體外抗氧化活性試驗(yàn)表明：紅藍(lán)草紅色素能顯著清除·OH、DPPH·，且與色素濃度呈正相關(guān)，存在一定的抗氧化活性。

優(yōu)化的紅藍(lán)草紅色素提取工藝合理、可行，這為將來(lái)更深入地研究紅藍(lán)草紅色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論支持。紅藍(lán)草紅色素能更好地滿(mǎn)足我國(guó)食品加工行業(yè)對(duì)食品天然色素的需求，開(kāi)發(fā)出更好的功能性食品。