于維凱，馮婷婷，陳曉兵，駱繼業(yè)，馮萬(wàn)文，王言理

1 連云港市第一人民醫(yī)院 急診內(nèi)科，江蘇 連云港 222000；2 連云港市市立東方醫(yī)院 骨科，江蘇 連云港 222042

肝細(xì)胞癌(HCC)是一種常見的惡性腫瘤，位居全球第三大癌癥相關(guān)死亡原因[1]，具有侵襲性、預(yù)后差、治療機(jī)會(huì)有限的臨床特點(diǎn)。目前，手術(shù)是HCC最常見的治療方式，但很多HCC發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除，導(dǎo)致患者預(yù)后很差[2]。因此，進(jìn)一步了解HCC進(jìn)展的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

越來(lái)越多的證據(jù)[3-4]表明，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)失調(diào)在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。circRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，具有高度保守性；與線性RNA相比，它具有共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)，因而比較穩(wěn)定且不易被RNA外切酶降解[5-6]。circRNAs廣泛存在于真核生物體內(nèi)，具有基因調(diào)控潛能，從而參與了增殖、侵襲、遷移、自噬、凋亡和代謝等多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程[7-9]。據(jù)報(bào)道[10-11]，circRNAs在很多疾病中異常表達(dá)，參與了這些疾病的進(jìn)展，并與預(yù)后密切相關(guān)。隨著高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的發(fā)展，許多circRNAs被發(fā)現(xiàn)在HCC中異常表達(dá)，可作為HCC的生物學(xué)標(biāo)志物，并參與了HCC的發(fā)生與發(fā)展[12-14]。

Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0091579可能在HCC進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用，并可能作為HCC患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。然而，在HCC中，并無(wú)hsa_circ_0091579相關(guān)功能及機(jī)制研究。因此，本研究在HCC細(xì)胞系中檢測(cè)hsa_circ_0091579的表達(dá)，并探索其對(duì)HCC細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 體外培養(yǎng)購(gòu)買于ATCC公司的人HCC細(xì)胞系SMMC-7721、HuH-7、MHCC-97H、HepG2和人正常肝細(xì)胞系HL-7702。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(Gibco，USA)的DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)。培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中。采用Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen，USA)將hsa_circ_0091579 siRNA及陰性對(duì)照(negative control，NC)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.2 RNA提取及qRT-PCR 根據(jù)說明書，使用Trizol試劑(Invitrogen)從細(xì)胞中提取總RNA，并使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。取1 μg總RNA，采用PrimeScript-RT試劑盒(Takara Bio，Japan)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以DNA為模板，使用SYBR Select Master Mix試劑盒(Applied Biosystems，USA)及ABI Prism 7900檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。hsa_circ_0091579的表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖能力采用CCK-8實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。細(xì)胞以5×103/孔的密度接種于96孔板，并轉(zhuǎn)染siRNA，在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24、48或72 h后，將10 μl CCK-8試劑(Transgen Biotech，USA)添加至每個(gè)孔中，并在37 ℃下孵育1 h。根據(jù)說明書在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞凋亡采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌，并使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(Solarbio)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，用FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞遷移能力。將細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用10 μl無(wú)菌吸頭尖劃傷單層細(xì)胞制造劃痕，用PBS洗滌細(xì)胞3次以沖掉劃下的細(xì)胞。加入無(wú)血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用光學(xué)顯微鏡對(duì)0 h和24 h的劃痕進(jìn)行拍照記錄，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 使用Transwell小室(Thermo Fisher Scientific)研究細(xì)胞侵襲能力。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化并用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，添加到涂有基質(zhì)膠的Transwell上室，下室加入含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基。小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，輕輕去除膜上的細(xì)胞，膜下的細(xì)胞用甲醇固定，結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)。

1.7 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用Circular RNA Interactome (https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)hsa_circ_0091579的靶microRNA(miRNA)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用pmirGLO載體(Promega)分別構(gòu)建野生型(wt)和突變型(mut)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。將熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和miRNA mimics共轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)(Promega)測(cè)定熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0091579在HCC細(xì)胞系中的表達(dá) 通過qRT-PCR檢測(cè)了人HCC細(xì)胞系和人正常肝細(xì)胞系中hsa_circ_0091579的表達(dá)情況，并進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示，人HCC細(xì)胞系SMMC-7721、HuH-7、MHCC-97H、HepG2中hsa_circ_0091579的表達(dá)水平明顯高于人正常肝細(xì)胞系HL-7702，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為14.27、36.34、26.70、36.16，P值均<0.001)(圖1)。

注：與HL-7702組比較，*P<0.05。

2.2 hsa_circ_0091579 siRNA設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染 針對(duì)hsa_circ_0091579的環(huán)化拼接位點(diǎn)設(shè)計(jì)siRNA，siRNA靶序列為ACCAGAGGCCTTTGAAATTGT(圖2a)，qRT-PCR結(jié)果顯示，在HepG2和HuH-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染hsa_circ_0091579 siRNA能夠明顯降低hsa_circ_0091579的表達(dá)水平(t值分別為14.22、27.20，P值分別為0.005、0.001)(圖2b)。

注：a，hsa_circ_0091579 siRNA 靶序列；b，qRT-PCR驗(yàn)證在HepG2和HuH-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染降低hsa_circ_0091579。與NC組比較，*P<0.05。

2.3 沉默hsa_circ_0091579對(duì)HCC細(xì)胞增殖和凋亡的影響 在HepG2和HuH-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染hsa_circ_0091579 siRNA，CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與NC組相比，沉默hsa_circ_0091579能夠在48 h和72 h明顯抑制HepG2和HuH-7細(xì)胞的增殖活性(P值均<0.05)(圖3)，并能夠明顯加速HepG2和HuH-7細(xì)胞的凋亡(t值分別為9.50、25.89，P值分別為0.011、0.002)(圖4)。

注：與NC組比較，*P<0.05。

2.4 沉默hsa_circ_0091579對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，沉默hsa_circ_0091579能夠明顯抑制HepG2和HuH-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力(t值分別為19.63、13.61、20.75、18.45，P值分別為0.003、0.005、0.002、0.003)(圖5、6)。

2.5 hsa_circ_0091579靶miRNAs預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 通過Circular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p可能是hsa_circ_0091579的靶miRNAs。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p均能明顯降低野生型熒光素酶質(zhì)粒的活性(t值分別為10.01、9.13、61.49，P值分別為0.010、0.012、<0.001)(圖7)。

3 討論

到目前為止，HCC進(jìn)展的機(jī)制仍不清楚，然而，越來(lái)越多的證據(jù)[16-17]表明，HCC的發(fā)生可能是由HBV感染、癌基因激活、抑癌基因失活所引起。近年來(lái)，非編碼RNA已成為肝癌研究的熱點(diǎn)。一些研究[18-19]已表明腫瘤特異性非編碼RNA可以應(yīng)用于生存預(yù)測(cè)和治療干預(yù)。部分異常調(diào)控的miRNAs和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是HCC耐藥性形成的重要調(diào)節(jié)因子，腫瘤特異性miRNAs和lncRNAs可作為HCC新的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物[20]。

注:a,HepG2；b，HuH-7。與NC組比較，*P<0.05。

注：a,HepG2；b,HuH-7。與NC組比較，*P<0.05。

在與HCC相關(guān)的非編碼RNA中，circRNA日益受到關(guān)注[21-22]。例如，異常表達(dá)circRNAs可用于區(qū)分HCC和健康人群，預(yù)測(cè)患者預(yù)后，并與腫瘤大小、分化程度、微血管浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、TNM分期及甲胎蛋白水平等臨床因素密切相關(guān)，提示異常表達(dá)的circRNAs可作為一種新的HCC診斷和預(yù)后的無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物[23]。circABCB10在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯增加，并通過調(diào)節(jié)miR-670-3p/HMG20A軸促進(jìn)HCC的進(jìn)展，可能是HCC的潛在治療靶點(diǎn)[24]。circ-0003418在HCC組織和細(xì)胞株表達(dá)下調(diào)，具有抗肝癌作用，通過抑制Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并提高HCC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[25]。

注：與NC組比較，*P<0.05。

本研究選取了hsa_circ_0091579作為研究對(duì)象。2018年，Zhang等[15]使用circRNA微陣列分析檢測(cè)了3例HCC伴癌栓患者腫瘤組織和配對(duì)正常肝組織中circRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0091579在癌組織中高表達(dá)；隨后他們用qRT-PCR在75對(duì)腫瘤組織和配對(duì)正常肝組織中進(jìn)行了驗(yàn)證，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0091579的高表達(dá)與HCC患者總體生存率差密切相關(guān)；但他們并沒有對(duì)hsa_circ_0091579在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)和功能做進(jìn)一步研究。在此基礎(chǔ)上，筆者推測(cè)hsa_circ_0091579可能在HCC的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的作用，因而做了進(jìn)一步探索。本研究結(jié)果顯示，hsa_circ_0091579在HCC細(xì)胞系中同樣高表達(dá)，這與其在人體組織中的高表達(dá)相符。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，在體外通過siRNA沉默hsa_circ_0091579后，HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲活性明顯降低，凋亡明顯加快。因此，筆者認(rèn)為hsa_circ_0091579可發(fā)揮癌基因的作用促進(jìn)HCC進(jìn)展，此結(jié)果也可解釋Zhang等[15]研究所報(bào)道的hsa_circ_0091579高表達(dá)能夠影響HCC患者生存率。

在多種癌癥中，circRNAs發(fā)揮其功能的一個(gè)重要機(jī)制是靶向結(jié)合部分腫瘤相關(guān)miRNAs，并抑制這些miRNAs的功能[26]。本研究中，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p可能是hsa_circ_0091579的靶miRNAs，并通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。已有研究[27-29]證實(shí)miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p在HCC中發(fā)揮抑癌基因的作用，抑制腫瘤進(jìn)展。因此，筆者認(rèn)為hsa_circ_0091579可能通過抑制上述具有抑癌作用的miRNAs發(fā)揮其癌基因的作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，hsa_circ_0091579在HCC細(xì)胞系中高表達(dá)；在體外HCC細(xì)胞系中沉默hsa_circ_0091579能夠抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。hsa_circ_0091579可能通過抑制miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p發(fā)揮癌基因的作用，其有希望成為有效的臨床治療靶點(diǎn)用于HCC的治療。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：于維凱、馮婷婷、馮萬(wàn)文負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；陳曉兵、駱繼業(yè)參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；于維凱、王言理負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。