王月月，季 偉，陳正榮，顧文婧

（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇蘇州 215003）

支氣管哮喘是一種復(fù)雜的慢性炎癥性疾病，以氣道炎癥、可逆性氣流受限和氣道高反應(yīng)性為主要特征，是兒童中最常見的非傳染性疾病。2018 年世界衛(wèi)生組織（WHO）的概況介紹顯示，在世界人口中，約有2.35 億人患有哮喘，作為一個(gè)全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，因其診斷及治療不足，給個(gè)人和家庭帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)［1］。從發(fā)病機(jī)制水平闡明哮喘的發(fā)病原因，外部干預(yù)從而改善哮喘癥狀，甚至根治哮喘是當(dāng)今醫(yī)學(xué)的一大重任。

至今報(bào)道的文獻(xiàn)中涉及哮喘發(fā)病機(jī)制眾多，與免疫、神經(jīng)、精神、內(nèi)分泌等密切相關(guān)，但發(fā)病機(jī)制仍無(wú)確切定論，目前比較認(rèn)可的為免疫方面學(xué)說(shuō)。經(jīng)典免疫學(xué)說(shuō)認(rèn)為Th1 細(xì)胞與Th2 細(xì)胞的比例失衡是哮喘發(fā)病的原因［2］。因此，糾正哮喘患者體內(nèi)的Th 細(xì)胞比例失衡可能是哮喘免疫治療的關(guān)鍵。

T 細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)［3］。第一信號(hào)為抗原提呈細(xì)胞（APC）處理后的MHC-抗原肽復(fù)合物，第二信號(hào)為抗原提呈細(xì)胞表面的共刺激分子。巨噬細(xì)胞是先天性的免疫細(xì)胞，通過(guò)識(shí)別，響應(yīng)和破壞入侵的微生物，抗原呈遞，清除細(xì)胞碎片來(lái)維持組織和免疫穩(wěn)態(tài)，以及產(chǎn)生炎癥調(diào)節(jié)產(chǎn)物，在T 細(xì)胞分化中發(fā)揮作用［4，5］。巨噬細(xì)胞自身的極化同樣影響T 細(xì) 胞 的 分 化［6］。B7‐H3 作 為 共 刺 激 分 子 的 一員，可以通過(guò)調(diào)節(jié)Th 細(xì)胞型炎癥因子影響T 細(xì)胞的分化［7，8］。近年來(lái)有研究報(bào)道稱，微小RNA 可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)氣道炎癥方面發(fā)揮重要作用［9，10］。有文獻(xiàn)報(bào)道哮喘的產(chǎn)生與某些miRNA 的異常表達(dá)相關(guān)，在OVA 誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 在肺組織中存在明顯的改變［10］，提示miRNA 參與氣道炎癥調(diào)節(jié)。

T 細(xì)胞的分化主要由APC 的種類及APC 表面的共刺激分子決定。筆者猜想可以通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子B7‐H3 及相關(guān)微小RNA 觀察巨噬細(xì)胞對(duì)T 細(xì)胞分化的影響。因此從B7‐H3入手，尋找調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞屬性的miRNA。由于巨噬細(xì)胞來(lái)源于單核細(xì)胞，筆者采集了哮喘患兒及外科手術(shù)正常兒童外周血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用基因芯片技術(shù)篩選相關(guān)的miRNAs，由于在哮喘患者中miR-29b 個(gè)體差異較小，哮喘組與對(duì)照組的差異倍數(shù)大，所以選擇了這個(gè)miR-29b 作為研究基因。通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞B7‐H3、miR-29b 的表達(dá)觀察其對(duì)CD4+T 細(xì)胞分化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年5 月～2019 年4 月在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院門診就診并符合哮喘診斷的患兒48 例，其中有25 例的患兒處于哮喘的急性發(fā)作期；23 例患兒處于哮喘非急性發(fā)作期，門診就診時(shí)抽取外周血。選取與哮喘患者就診時(shí)間相當(dāng)?shù)耐饪苹純海ㄗ≡耗康闹饕獮閾衿谑中g(shù)：包括疝氣修補(bǔ)手術(shù)、包皮切除手術(shù)）15 例作為對(duì)照組，術(shù)前抽取外周血。對(duì)照組患兒及家族成員無(wú)過(guò)敏性疾病史，近1 個(gè)月無(wú)感染史無(wú)用藥史。上述研究得到蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（倫理號(hào)：2020CS039），患兒家屬同意抽血檢查。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）［11］。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

人外周血單個(gè)核細(xì)胞及CD4+T 細(xì)胞的分離參照說(shuō)明書操作。

THP-1 細(xì)胞用PMA 試劑誘導(dǎo)分化為單核巨噬細(xì)胞：THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度50 ng/mL 的PMA 培養(yǎng)6 h，換無(wú)PMA 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

miR-29b 上、下調(diào)對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響：接種THP-1 細(xì)胞，加終濃度為50 ng/mL 的PMA 培養(yǎng)6 h后，換無(wú)PMA 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用LV526、LV527 和NC 病毒侵染誘導(dǎo)成功的巨噬細(xì)胞，24 h 收集樣品進(jìn)行Q-PCR 檢測(cè)，分析miR-29b上、下調(diào)對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響。

細(xì)胞共培養(yǎng)：6 孔板中準(zhǔn)備貼壁單核巨噬細(xì)胞5×105個(gè)/孔，按巨噬細(xì)胞與CD4+T 細(xì)胞1︰10 比例，準(zhǔn)備0.4 μm 孔徑的6 孔板transwell 小室，上室加入含5×106個(gè)CD4+T 細(xì)胞的培養(yǎng)液1 mL；貼壁培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的6 孔板為下室，換液加培養(yǎng)液2 mL；共培養(yǎng)3 d。然后收集CD4+T 細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

細(xì)胞共培養(yǎng)分組：組1：?jiǎn)?dòng)活化的CD4+T 細(xì)胞，（用PMA（20 ng/mL）+Ionomycin（1 μg/mL）在37℃下處理細(xì)胞1 h；組2：KD-miR-29b 的巨噬細(xì)胞（下調(diào)miR-29b 的巨噬細(xì)胞）與啟動(dòng)活化的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)；組3：NC-巨噬細(xì)胞（空載病毒的巨噬細(xì)胞）與啟動(dòng)活化的CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)。

驗(yàn)證STAT3 為miR-29b 的靶基因：接種THP-1 細(xì)胞，加終濃度為50 ng/mL 的PMA 培養(yǎng)6 h 后，換無(wú)PMA 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用LV528、LV529 和NC 病毒侵染誘導(dǎo)成功的巨噬細(xì)胞形成miR-29b 干擾、miR-29b 過(guò)表達(dá)以及正常對(duì)照組，48 h 進(jìn)行熒光素酶分析來(lái)驗(yàn)證STAT3 為miR-29b 的靶基因。構(gòu)建STAT3-3′-UTR 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并分為3 組“miR-29b+STAT3-3′-UTR”、“miR-29b + STAT3-mut-3′-UTR”、“miR-29b+ 熒光素酶空載”。

逆轉(zhuǎn)錄及定量Q-PCR 參照說(shuō)明書操作，引物序列見表1。

1.3.1 Western blot 步驟 取樣品采用BCA 法測(cè)濃度，上樣40 μg，聚丙烯酰胺凝膠先90 V 跑完積層膠，再將電壓升至200 V 直到電泳結(jié)束。取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓100 V轉(zhuǎn)膜，約為1.5 h，恒流250 mA. 電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取下膜后先用PBST 洗滌4 次，每次5 min。將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉37℃1 h。用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中4℃過(guò)夜。次日將膜取出后用PBST 洗膜4 次，每次5 min，用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗。膜在二抗中37℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢后，把膜取出后置于干凈的盒子中洗膜4次，每次5 min。ECL 顯影，曝光。

1.3.2 主要試劑及設(shè)備 材料：THP-1 細(xì)胞（諾百生物）、人外周血淋巴細(xì)胞（蘇州市血站健康捐獻(xiàn)者）。

細(xì)胞培養(yǎng)及分離所需試劑：FBS（美國(guó)Hyclone公司）、1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司）、PMA（碧云天）、Ficoll 人血淋巴細(xì)胞分離液（GE Healthcare 美國(guó)）、磁珠（Miltenyi CD4+T Cell Isolation Kit）、Transwell小室（Corning 公司）。

PCR 實(shí)驗(yàn)所需試劑：引物合成（蘇州金唯智）、Trizol（Sigma 德國(guó)）、異丙醇、氯仿、DEPC 水（上海生工）、75%乙醇（30 mL 無(wú)水乙醇+10 mLDEPC水配置）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega 美國(guó)）、SYBR Green（Roche 瑞士）。

表1 Q-PCR 引物序列Tab 1 Primer sequence of Q-PCR

Western blot 所 需 試 劑：1×PBS（NaCl：8 g、KCl：0.2 g、Na2HPO4：1.44 g、KH2PO4：0.27 g，雙蒸水定容至1 L）、三羥基甲基氨基甲烷（Trizmabase）、甘氨酸（Glycine）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、氯化鈉、過(guò)硫酸銨（AP）、30%丙烯酰胺溶液（生工）、TEMED（四甲基乙二胺）（BIO-RAD 公司）、Tris-HCl（Sigma 公 司），甲 醇、Tween-20、5×SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液（碧云天）、預(yù)染蛋白marker 10～180 kD（ThermoFisher）、封閉專用脫脂奶粉（普利萊）、BSA（牛血清白蛋白）（Biotopped）、Western blot 超敏發(fā)光液（普利萊）、PVDF 膜（Millipore）。

一抗：PI3K、P-PI3K（Bioss 公司）；二抗：羊抗兔-HRP（biovol 公司）；Protein Marker（TransGen公司）。

設(shè)備：超凈工作臺(tái)（AIRTECH）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo）、超低溫冰箱（?70℃）（海爾公司）、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Thermo）、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（Costar公司）、倒置顯微鏡（Olympus）、熒光定量PCR 儀（Roche LightCycler480Ⅱ）、梯度PCR 儀（ABI veri‐ti96-well）、微量分光光度計(jì)BioMate3S（Thermo）、凝膠成像系統(tǒng)（GE Imager 600）、蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用Graphpad8.0 及SPSS21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，非正態(tài)分布資料以中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 直線相關(guān)分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況比較

各組年齡及性別構(gòu)成比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；哮喘急性發(fā)作期組患兒其他變應(yīng)性疾病史發(fā)生率高于其他兩組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032）；對(duì)照組無(wú)哮喘家族史，與其他兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001）。見表2。

2.2 各組外周血單個(gè)核細(xì)胞中B7H3、miR‐29b 的相對(duì)表達(dá)量

哮喘急性發(fā)作期組PBMC 中B7H3 表達(dá)量高于哮喘非急性發(fā)作期組與對(duì)照組。對(duì)照組PBMC 中miR?29b 表達(dá)量明顯高于哮喘患兒非急性發(fā)作期組與急性發(fā)作期組，任意兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表3。

2.3 miR‐29b 上、下調(diào)對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響

沉默表達(dá)miR-29b 后IL-4Rα、IL-4、IL-5、IL-13、CD206 明顯升高，而IFN-γ 下降，提示下調(diào)miR-29b 可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 極化。見表4。

2.4 不同分組中熒光素酶的表達(dá)量

miR-29b+STAT3 的3UTR 野生型熒光素酶表 達(dá) 量 為0.11±0.01，miR-29b+STAT3 的3UTR突變型為0.35±0.01，miR-29b+熒光素酶空載為0.33±0.02。與其他組比較，僅miR-29b+STAT3-3′-UTR（野生型）組熒光素酶表達(dá)量下降（P<0.05），證 實(shí)miR-29b 可 以 直 接 結(jié) 合 于STAT3-3′-UTR。

表2 入組患兒一般情況比較Tab 2 General information of patients

表3 不同分組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中B7?H3、miR?29b 的相對(duì)表達(dá)量Tab 3 Relative expression of B7?H3 and miR?29b in mono?cytes

2.5 巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)

miR-29b，STAT3、B7-H3 基因水平及蛋白水平表達(dá)下降；抑制miR-29b，STAT3、B7-H3 基因水平及蛋白水平表達(dá)上升。見圖1～2，表5。

2.6 巨噬細(xì)胞B7-H3 與STAT3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析

巨噬細(xì)胞STAT3 與B7-H3 mRNA 的表達(dá)成顯著正相關(guān)（r=0.973 7，P<0.000 1），見圖3。

2.7 不同分組中T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量

巨噬細(xì)胞與活化的CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)，可促進(jìn)初始T 細(xì)胞即Th0 細(xì)胞向Th2 方向分化，其中下調(diào)miR-29b 的巨噬細(xì)胞促進(jìn)作用更明顯。見表6。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中STAT3、B7?H3 的蛋白表達(dá)水平Fig 1 Protein expression of STAT3 and B7-H3 in macro?phages by Western blotting

圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中STAT3、B7?H3 mRNA 的蛋白表達(dá)水平（相對(duì)灰度值）Fig 2 Gene expression of STAT3 and B7-H3 in macro?phages by Western blotting

表4 巨噬細(xì)胞上、下調(diào)miR-29b 后相關(guān)基因的表達(dá)（±s）Tab 4 Expression of relative genes after regulating miR‐29b in macrophages（±s）

表4 巨噬細(xì)胞上、下調(diào)miR-29b 后相關(guān)基因的表達(dá)（±s）Tab 4 Expression of relative genes after regulating miR‐29b in macrophages（±s）

組別NC 對(duì)照組miR‐29b 干擾組miR‐29b 過(guò)表達(dá)組IFN‐γ 0.96±0.04 0.22±0.06*0.87±0.15 52.87<0.001 FP IL‐4Rα 1.01±0.04 3.61±0.45*1.17±0.20 78.45<0.001 CD206/MRC1 0.93±0.13 5.91±0.35*1.29±0.04 481.02<0.001 IL‐4 0.88±0.13 3.84±0.54*0.81±0.11 83.33<0.001 IL‐5 0.86±0.16 3.99±0.32*0.68±0.02 246.05<0.001 IL‐13 1.06±0.12 3.55±0.44*0.75±0.23 82.17<0.001

表5 不同處理方式的巨噬細(xì)胞中STAT3 及B7-H3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab 5 mRNA expression of STAT3 and B7-H3 in macro?phages（±s）

表5 不同處理方式的巨噬細(xì)胞中STAT3 及B7-H3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab 5 mRNA expression of STAT3 and B7-H3 in macro?phages（±s）

注：與NC 對(duì)照組相比，*P<0.05。

B7‐H3 1.06±0.07 0.49±0.04*1.70±0.15*111.6<0.001組別NC 對(duì)照組miR‐29b 干擾組miR‐29b 過(guò)表達(dá)組FP STAT3 0.94±0.06 0.39±0.02*1.75±0.14*175.96<0.001

圖3 巨噬細(xì)胞B7?H3 與STAT3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析Fig 3 Correlation between mRAN expression of STAT3 and B7-H3 in macrophages

表6 不同分組中T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量（±s）Tab 6 Expression of transcription factors of T cel（l±s）

表6 不同分組中T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量（±s）Tab 6 Expression of transcription factors of T cel（l±s）

注：K D 為下調(diào)miR‐29b 的巨噬細(xì)胞；NC 為空載病毒巨噬細(xì)胞組；與CD4+T 細(xì)胞組相比，*P<0.05。

ROR‐γt 1.04±0.04 0.38±0.04*0.75±0.02*261.3<0.001組別CD4+T KD/CD4+T NC/CD4+T FP T‐bet 0.95±0.06 0.25±0.01*0.67±0.04*186.42<0.001 GATA3 0.99±0.02 1.86±0.14*1.48±0.05*73.38<0.001

3 討論

我國(guó)第三次城市兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)城市0～14 歲兒童哮喘兩年現(xiàn)患率為0.42%～5.73%，平均為2.32%，累計(jì)患病率為0.48%～7.57%，平均為3.02%，患病率較10 年前有所增加［12］。具有哮喘家族史的兒童較無(wú)哮喘家族史的兒童更易罹患哮喘，相對(duì)危險(xiǎn)度為6.20［13，14］，遺傳因素在哮喘的發(fā)病中起著重要的作用。有研究表明，具有變應(yīng)性疾病的患兒更易患哮喘，而且患有變應(yīng)性疾病的患兒哮喘易持續(xù)至青春期。本研究中哮喘急性發(fā)作期與非急性發(fā)作期哮喘家族史的比例及其他變應(yīng)性疾病的比例遠(yuǎn)高于對(duì)照組，與他人的研究結(jié)果相似。

根據(jù)不同的微環(huán)境，巨噬細(xì)胞可以分化成不同的亞型，主要分為兩個(gè)類型：經(jīng)典的M1 型巨噬細(xì)胞以 及 旁 路M2 型 巨 噬 細(xì) 胞［17，18］。其 中M2 型 巨 噬 細(xì)胞在抑制Th1 型炎癥反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，增強(qiáng)Th2 型炎癥反應(yīng)［19，20］。參與巨噬細(xì)胞極化的信號(hào)分子及通路眾多，如JNK、PI3K/Akt、Notch、JAK/STAT、TGF- β/SMAD 以 及TLR/NF-κB 等信號(hào)途徑。文獻(xiàn)報(bào)道稱LPS 處理后巨噬細(xì)胞IL-6/STAT3 信號(hào)通路受到抑制，但I(xiàn)L-4 誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞激活。IL-6/STAT3 信號(hào)通路參與了M1/M2 巨噬細(xì)胞極化［21］。本研究得出在巨噬細(xì)胞中下調(diào)miR-29b，巨噬細(xì)胞向M2 方向極化，且巨噬細(xì)胞中miR-29bDE 靶基因STAT3 表達(dá)增多，證實(shí)STAT3 參與巨噬細(xì)胞的極化，且下調(diào)miR-29b 的巨噬細(xì)胞與CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)，CD4+T 細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化；在哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中存在miR-29b 的低表達(dá)，因此哮喘患兒體內(nèi)的巨噬細(xì)胞向M2 方向極化，表現(xiàn)為高Th2 型炎癥反應(yīng)。

B7-H3 作為抗原提呈細(xì)胞細(xì)胞表面的共刺激分子，對(duì)CD4+T 細(xì)胞的分化具有重要的作用，既往研究提示，哮喘患者體內(nèi)存在高表達(dá)的sB7-H3，其與哮喘患者體內(nèi)低水平的IFN-γ 成正相關(guān)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證明B7-H3 可以加重哮喘小鼠氣道炎癥表現(xiàn)，以Th2 細(xì)胞型免疫反應(yīng)為主［8］。本研究得出B7-H3 與STAT3 存在協(xié)同作用，兩者可協(xié)同增強(qiáng)Th2型炎癥反應(yīng)。

所述哮喘患者體內(nèi)存在低表達(dá)的miR-29b，巨噬細(xì)胞中STAT3 表達(dá)增加，影響巨噬細(xì)胞向M2 極化，協(xié)同共刺激分子B7-H3 促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞向Th2方向極化，加重哮喘癥狀。