施玉博，余 鈴，郭衛(wèi)春

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院脊柱外科，湖北武漢430060）

急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）是一種由交通事故、高空墜落、運動損傷等原因所致脊髓受壓，在脊髓損傷平面以下出現(xiàn)感覺、運動功能障礙、膀胱直腸括約肌功能喪失以及肌張力異常等臨床癥狀［1，2］。根據(jù)損傷機制不同，脊髓損傷可分為原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷［3，4］。原發(fā)性脊髓損傷主要由機械性損傷導(dǎo)致，繼發(fā)性脊髓損傷是指脊髓損傷后出現(xiàn)廣泛性水腫，由于受到骨性結(jié)構(gòu)的限制以及硬脊膜的壓迫，脊髓內(nèi)水腫加重，導(dǎo)致脊髓微循環(huán)障礙、血栓形成、血管痙攣和組織缺氧，引起脊髓缺血，出血以及壞死［5，6］。因此，減輕繼發(fā)性脊髓損傷的程度是治療的關(guān)鍵。

目前，臨床上常采用硬膜外減壓的手術(shù)方式治療急性脊髓損傷［7，8］。但是，由于硬膜為堅韌無彈性的組織，在硬膜外減壓后，硬膜組織仍會對腫脹的脊髓產(chǎn)生壓迫，從而導(dǎo)致脊髓出現(xiàn)缺血、壞死等繼發(fā)性損傷［9］。以往研究發(fā)現(xiàn)，由于硬脊膜切開術(shù)破壞了硬脊膜的完整性，因此不利于脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)［10，11］。硬脊膜擴大成形術(shù)通過將硬脊膜補片覆蓋在脊髓損傷部位，一方面能夠為腫脹脊髓提供膨出的空間，另一方面維持了硬脊膜的完整性，因而更加有利于脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。因此，本研究通過建立脊髓損傷模型，對脊髓損傷的大鼠進行硬脊膜擴大成形術(shù)，觀察硬脊膜擴大成形術(shù)對大鼠急性脊髓損傷的療效，初步探討硬脊膜擴大成形術(shù)治療脊髓損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成 年SD 大 鼠42 只，雄 性，8～12 周 齡，體 重280～300g。檢驗合格證編號NO.43004700061116，生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2019-004。動物購入后先進行適應(yīng)性飼養(yǎng)，為期1 周，保持環(huán)境安靜整潔，通風(fēng)良好，溫度22～25 ℃。所有動物實驗經(jīng)過武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物倫理學(xué)委員會的同意和批準，動物福利審查編號第2019027 號。

1.2 實驗設(shè)備及儀器

瑞沃德脊髓損傷儀（瑞沃德生命科技有限公司，型號：68097），輪轉(zhuǎn)切片機（上海涵飛科技公司，型號：KD-2268），HE 和LFB 染色試劑盒（武漢賽維爾科技公司，貨號：G1005，G1103），兔源GFAP‐抗（濃度1∶800，武漢賽維爾科技公司，貨號：GB11096），羊抗兔二抗（濃度1∶300，武漢賽維爾科技公司，貨號：GB12096）

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及硬脊膜制備 選取成年SD 大鼠42 只，按隨機數(shù)表法分為脊髓損傷組（對照組）、硬脊膜切開組和硬脊膜擴大成形組，每組各12 只，剩余6 只用于制備硬脊膜。6 只健康成年大鼠行腹腔注射10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）進行麻醉，麻醉處死后，從大鼠脊髓組織表面剝離硬脊膜，并將硬脊膜修剪成約為1.2 cm×1.2 cm 大小。將該新鮮硬脊膜膜置于培養(yǎng)皿中，室溫儲存于Hanks 平衡鹽溶液中，保持適當(dāng)?shù)谋砻嫒∠颉?/p>

1.3.2 脊髓損傷模型及手術(shù)過程 所有大鼠采用10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后將大鼠以俯臥位固定于手術(shù)臺上，胸背部脫毛，酒精消毒，常規(guī)消毒鋪巾，以T10棘突為中心，沿脊柱方向作后正中切口，長度約3.0 cm。逐層切開皮膚和皮下組織，鈍性分離椎旁肌肉并充分止血，再次確定并暴露T9～T11棘突，用椎板咬骨鉗咬除T9下椎板及T10全部椎板，暴露硬脊膜。本研究采用Allen 法［12］建立脊髓損傷模型。將大鼠固定在瑞沃德脊髓損傷儀底座上，以T10脊髓背側(cè)血管為中心點，將套管下端墊片與中心點緊密貼附，重量為60 g 的砝碼自30 cm 高處順著套管垂直下落，形成全脊髓損傷模型。造模成功的標準：大鼠雙下肢出現(xiàn)不同程度抽搐，尾巴開始甩動，隨后出現(xiàn)遲緩性癱瘓。根據(jù)分組，脊髓損傷組在脊髓損傷造模成功后，逐層縫合肌肉筋膜及皮膚；硬脊膜切開組在脊髓損傷造模成功后，逐層縫合肌肉筋膜及皮膚并在飼養(yǎng)籠恢復(fù)6 h，隨后大鼠再次麻醉成功后，充分暴露損傷部位，剪開脊髓損傷部位硬膜（約1.0 cm），暴露脊髓，并清除硬膜內(nèi)殘留的出血和血凝塊，硬膜不縫合，徹底止血后逐層縫合肌肉筋膜及皮膚；硬脊膜擴大成形組重復(fù)硬脊膜切開組之前的實驗步驟，與之不同的是，前者在硬膜切開后，將同種異體硬脊膜以正確的表面取向覆蓋在硬脊膜切除部位的邊緣，用7-0帶線縫合針仔細縫合，確保移植物和宿主硬脊膜之間緊密相連，徹底止血后逐層縫合肌肉筋膜及皮膚。術(shù)后給予腹腔注射青霉素鉀20 000 IU 以預(yù)防傷口及尿路感染，每天1次，持續(xù)3 d。大鼠定時進行人工膀胱區(qū)按摩排尿，每天3次，直至大鼠可自主排尿即止。保持籠內(nèi)衛(wèi)生整潔，勤換墊料，保持干燥。

1.4 觀察指標

大鼠后肢運動功能評分完成后，以10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后處死大鼠，再次暴露脊髓損傷部位，剪斷神經(jīng)根，取出脊髓損傷處及周邊正常的組織，多聚甲醛常溫固定24 h，經(jīng)石蠟包埋后切片（約4 μm），然后進行各類組織病理染色。

1.4.1 后肢運動功能評分 采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分對大鼠后肢運動功能進行評價［13］。BBB 評分是指將大鼠放入透明玻璃箱中，輕敲箱壁，觀察大鼠臀、膝、踝關(guān)節(jié)行走，軀干運動及其協(xié)調(diào)情況。所有大鼠術(shù)前3 d 進行適應(yīng)性訓(xùn)練，依次記錄大鼠術(shù)后1、3、7、14、21、28 d 的評分。數(shù)據(jù)記錄由兩名對實驗分組未知的人員共同完成。

1.4.2 脊髓組織蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 切片二甲苯脫蠟后水化，根據(jù)蘇木精-伊紅染色試劑盒說明書進行染色，脫水透明后封片。用顯微鏡對HE 切片進行連續(xù)拍照，描繪出脊髓損傷區(qū)域邊界，利用Image J 軟件進行三維重建，計算脊髓損傷空洞體積。

1.4.3 脊髓組織勞克堅牢藍（luxol fast blue，LFB）染色 切片脫蠟后水化，0.1% LFB 溶液密封浸染8～16 h，酒精分色直至清晰顯示白質(zhì)、灰質(zhì)界限為止，焦油紫溶液復(fù)染后，脫色透明封片。以脊髓損傷為中點，計算4 mm（頭尾兩端各2 mm）長度的脊髓LFB 染色的積分光密度（integrated optical densi‐ty，IOD）值，利用Ipp 6.0 軟件計算髓鞘的IOD 值。

1.4.4 脊髓組織膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）染色 切片脫蠟后入水，采用檸檬酸抗原修復(fù)液高壓修復(fù)抗原，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后滴加一抗，4 ℃冰箱過夜，滴加二抗，37 ℃孵育40 min，滴加辣根過氧化物酶標記酶卵白素，加入DAB 顯色，蘇木紫復(fù)染，酒精分色后自來水沖洗10 min，梯度酒精脫水后透明封片。GFAP 陽性（+）細胞計數(shù)采用顯微攝像系統(tǒng)進行計算，每張切片選取4 個不同的視野（放大倍數(shù)400 倍）進行計數(shù)，計算每個視野GFAP+細胞數(shù)量后取均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD 統(tǒng)計方法，重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量的方法分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況

所有動物造模成功，本次實驗共有3 只大鼠死亡，其中脊髓損傷組、硬脊膜切開組和硬脊膜擴大成形組各有1 只，死亡時間主要在脊髓損傷后的3 d內(nèi)，死亡原因為尿路感染、傷口失血性休克和拒絕進食，每組死亡大鼠均予以補充。

2.2 后肢運動功能恢復(fù)情況

整體分析發(fā)現(xiàn)，組間比較、時間點比較及交互 作 用 差 異 均 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（F時間×組間=4.38，P時間×組間<0.05），提示3 組大鼠BBB 評分在不同時間點存在顯著差異。進一步兩兩比較，組內(nèi)比較：硬脊膜擴大成形組大鼠的BBB 評分隨著時間的進展，呈上升趨勢，脊髓損傷組和硬脊膜切開組大鼠的BBB 評分隨著時間的進展，上升趨勢逐漸平緩；組間比較：術(shù)后7 d 和21 d，硬脊膜擴大成形術(shù)組大鼠BBB 評分較脊髓損傷組顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），術(shù)后14 d 和28 d，硬脊膜擴大成形術(shù)組大鼠BBB 評分較硬脊膜切開組顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。硬脊膜切開組大鼠BBB 評分雖然較脊髓損傷組下降，但在各時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 術(shù)后不同時間點3 組大鼠BBB 評分（n=12，±s）Tab 1 BBB scores of rats in three groups at different time points postoperatively（n=12，±s）

表1 術(shù)后不同時間點3 組大鼠BBB 評分（n=12，±s）Tab 1 BBB scores of rats in three groups at different time points postoperatively（n=12，±s）

組別脊髓損傷組硬脊膜切開組硬脊膜擴大成形組術(shù)后1 d 000 FP術(shù)后3 d 1.39±0.51 1.25±0.75 1.42±0.56 0.303 0.740術(shù)后7 d 4.41±0.51 5.02±0.66 5.58±1.16 5.960 0.006術(shù)后14 d 8.16±0.83 7.66±1.82 8.66±0.49 3.200 0.038術(shù)后21 d 8.41±1.08 8.00±1.53 9.34±0.78 4.042 0.027術(shù)后28 d 9.34±0.98 8.75±1.54 10.16±0.83 4.500 0.019

2.3 脊髓HE 染色結(jié)果

HE 染色用于評估大鼠脊髓空洞體積。各組均有白質(zhì)、灰質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞及空洞形成，脊髓損傷組結(jié)構(gòu)更為疏松。脊髓損傷組、硬脊膜切開組和硬脊膜擴大成形組的脊髓損傷空洞體積分別為（39.71±4.08）、（38.05±3.81）、（36.15±4.22）mm3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.288，P=0.018）。硬脊膜擴大成形組脊髓損傷空洞體積低于脊髓損傷組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.14，P=0.04）。硬脊膜擴大成形組與硬脊膜切開組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.14，P=0.262）。見圖1、2。

圖1 脊髓組織HE 染色（×50）Fig 1 H & E staining of spinal cord tissue（×50）

圖2 脊髓損傷空洞體積Fig 2 Lesion volume of spinal cord injury

2.4 脊髓LFB 染色結(jié)果

LFB 染色用于評估白質(zhì)剩余量，與硬脊膜擴大成形相比，脊髓損傷組白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，脫髓鞘明顯。脊髓損傷組、硬脊膜切開組和硬脊膜擴大成形組的脊 髓 白 質(zhì)IOD 值 分 別 為（1.46±0.43），（1.86±0.47），（2.62±0.48），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.867，P<0.01）。硬脊膜擴大成形組脊髓白質(zhì)IOD 值高于脊髓損傷組和硬脊膜切開組，差異具有統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（t=4.99，P<0.01；t=3.27，P=0.004）。硬脊膜切開組IOD 值較脊髓損傷組輕微增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.72，P=0.1）。見圖3、4。

圖3 脊髓組織LFB 染色（×50）Fig 3 Luxol fast blue（LFB）staining of spinal cord tissue（×50）

圖4 脊髓白質(zhì)IOD 值Fig 4 Integrated optical density（IOD）score of white matter of spinal cord

2.5 脊髓GFAP 染色結(jié)果

GFAP 染色用于評估星形膠質(zhì)細胞增生情況，細胞染色為棕黃色，與硬脊膜擴大成形相比，脊髓損傷組星形膠質(zhì)細胞胞體增大，硬脊膜切開組突觸增多、延長。脊髓損傷組、硬脊膜切開組和硬脊膜擴大成形組的GFAP+細胞計數(shù)分別為（20.08±2.53）、（21.16±2.28）、（17.66±2.49）個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.446，P=0.004）。硬脊膜擴大成形組GFAP+細胞計數(shù)結(jié)果低于脊髓損傷組和硬脊膜切開組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.42，P=0.021；t=3.5，P=0.001）。硬脊膜切開組GFAP+細胞數(shù)目較脊髓損傷組輕微升高，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.08，P=0.286）。見圖5、6。

圖5 脊髓組織GFAP 染色（×400）Fig 5 Glial fibrillary acidic protein（GFAP）staining of spinal cord tissue（×400）

圖6 GFAP+細胞計數(shù)結(jié)果Fig 6 The number of glial fibrillary acidic protein（GFAP）positive（+）cells of spinal cord

3 討論

急性脊髓損傷機制包括原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。原發(fā)性脊髓損傷主要由于脊髓受到重擊、牽拉等物理因素而產(chǎn)生的神經(jīng)元壞死和血管結(jié)構(gòu)的破壞［14，15］。繼發(fā)性脊髓損傷主要包括脊髓的水腫、缺血以及腦脊液壓力的改變等方面［16］。原發(fā)性脊髓損傷通常難以逆轉(zhuǎn)，因此，治療的關(guān)鍵在于降低繼發(fā)性損傷的程度。盡管傳統(tǒng)的硬脊膜外減壓手術(shù)能夠減輕硬膜外壓力、改善脊髓損傷患者的預(yù)后，但由于其無法解除硬脊膜對脊髓的壓迫，脊髓仍會進一步水腫缺血，引起腦脊液壓力的改變［17，18］。本研究顯示，硬脊膜擴大成形術(shù)可以促進脊髓損傷大鼠運動功能的恢復(fù)，減少脊髓損傷空洞體積，抑制脊髓脫髓鞘變性，減少瘢痕組織形成。

脊髓損傷后，硬脊膜會對腫脹脊髓的產(chǎn)生持續(xù)性壓迫，導(dǎo)致脊髓實質(zhì)內(nèi)壓力增高，引起脊髓微循環(huán)障礙。增高的實質(zhì)內(nèi)壓力會限制脊髓內(nèi)微靜脈回流，加劇脊髓內(nèi)缺血缺氧的環(huán)境［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷的大鼠在硬脊膜切開后，脊髓通過硬脊膜切口向外突出形成“疝”樣結(jié)構(gòu)，證實脊髓損傷后會導(dǎo)致脊髓實質(zhì)性水腫。另外，腦脊液壓力的改變也會對脊髓水腫和缺血產(chǎn)生影響［20］。脊髓損傷后，腫脹的脊髓會堵塞硬膜下間隙，阻塞正常的腦脊液的流動，造成壓力梯度的改變，從而導(dǎo)致硬膜內(nèi)壓力增高，而硬膜內(nèi)壓力的增高會進一步導(dǎo)致脊髓水腫。Kwon 等［18］利用腦脊液引流的方法治療大鼠脊髓損傷，結(jié)果顯示該術(shù)式能夠降低硬膜內(nèi)壓力，改善腦脊液循環(huán)，促進脊髓損傷大鼠功能的恢復(fù)。本實驗結(jié)果顯示，與脊髓損傷組相比，硬脊膜擴大成形術(shù)組能夠顯著改善大鼠運動功能和組織學(xué)情況，推測硬脊膜擴大成形術(shù)能夠為腫脹的脊髓提供向外膨出的空間，降低硬膜內(nèi)壓力，改善腦脊液壓力梯度，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

既往有研究探討了硬脊膜完整性在脊髓損傷中的作用。Iannotti 等［21］利用硬脊膜撕裂模型觀察脊髓損傷的組織學(xué)反應(yīng)，其結(jié)果顯示，與硬脊膜撕裂組相比，成年大鼠在接受同種異體硬脊膜移植后，脊髓損傷囊性空洞面積減小，脊髓損傷部位巨噬細胞浸潤減少，并改善了腦脊液循環(huán)情況，推測硬脊膜的完整性能夠維持正常腦脊液的生理狀態(tài)，并防止硬膜外生長抑制因子和炎癥因子對神經(jīng)再生的影響。在另外一項脊髓鉗夾損傷模型中，Zhang 等［22］發(fā)現(xiàn)完整的硬膜能夠抑制硬膜外成纖維細胞的增殖和瘢痕組織的形成。本實驗結(jié)果顯示，硬脊膜擴大成形術(shù)組GFAP+細胞數(shù)顯著低于硬脊膜切開組，進一步證實硬脊膜完整性對脊髓損傷的神經(jīng)保護作用。

需要說明的是，本實驗存在一定的局限性。本研究模型需要在脊髓損傷之前將棘突椎板切除，而臨床上脊髓損傷的患者常伴有椎體骨折移位，會對脊髓造成骨性結(jié)構(gòu)的壓迫，因此，該研究中所采用的脊髓損傷造模方式并不能真實還原臨床上脊髓損傷的情況。另外，本次研究沒有設(shè)立假手術(shù)組（即只打開椎板，不做脊髓損傷造模），關(guān)于單純切除椎板是否會對大鼠脊髓造成損傷，仍需進一步研究。

綜上所述，硬脊膜擴大成形術(shù)可以減少脊髓損傷空洞體積、抑制脫髓鞘變性及膠質(zhì)瘢痕的形成，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。盡管本實驗結(jié)果顯示硬脊膜擴大成形術(shù)能夠減輕繼發(fā)性損傷的程度，改善神經(jīng)功能恢復(fù)，但有待于更深入的基礎(chǔ)研究以及更多的臨床療效證實其療效。