凌學(xué)斌，王 軍，綦苗苗，李繼科，郭峻莉，李天發(fā)

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，心血管病研究所，海南海口570102）

細(xì)胞凋亡是引起心力衰竭的重要病理機(jī)制，常見誘因包括心肌缺血再灌注（ischemia/reper‐fusion，I/R）損傷、慢性壓力負(fù)荷及充血性心力衰竭［1］。I/R 損傷常見于溶栓、冠狀動脈介入或搭橋、心臟移植術(shù)等治療中，是臨床上治療缺血性心臟病的常用方法，但可誘發(fā)心肌頓抑、再灌注惡性心律失常、心肌細(xì)胞凋亡及心臟收縮和舒 張 功 能 不 全［2］。 研 究 發(fā) 現(xiàn) 活 性 氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可進(jìn)一步活 化MAPKs 通 路［3］，是 心 肌I/R 損 傷 的 重 要 病理 過 程。ROS 包 括O2??、·OH、ONOO-、H2O2等，目前被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)第二信使，影響著細(xì)胞增殖、分 化、凋 亡 及 壞 死 等 過 程［4］。MAPKs 為 絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、氨基末端激酶（JNK）及p38，通過磷酸化下游產(chǎn)物調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)。目前有關(guān)心肌細(xì)胞I/R 損傷的研究常使用具有成熟心肌細(xì)胞特性的H9c2 心肌細(xì)胞株，通過建立缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型來完成。H9c2細(xì) 胞 經(jīng)H/R 處 理 后 可 激 活ROS/ERK［3］、ROS/JNK［3，5］及ROS/p38［6］通 路，進(jìn) 而 誘 導(dǎo) 心 肌 細(xì) 胞凋亡。目前尚少有研究關(guān)注ROS 對ERK、JNK及p38 活性水平的表達(dá)是否存在差異以及缺氧、H/R 對上述通路是否存在影響。本研究通過CoCl2誘導(dǎo)H9c2 缺氧，使用完全培養(yǎng)基模擬I/R損傷病理過程，比較常氧、缺氧與H/R 條件下ROS 水 平、MAPKs 及Caspase-3 活 性 變 化，探 討ROS/MAPKs 通路對H9c2 心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高糖DMEM 培養(yǎng)基購自hyclone 公司，胎牛血清購自BI 公司，青鏈霉素購自索萊寶公司，CoCl2·6H2O、兔抗磷酸化JNK（p-JNK）、兔抗p-ERK1/2 購自生工生物工程有限公司，兔抗p-p38、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗購自Santa Cruze 公司，細(xì)胞裂解液、兔抗α-Tubulin、兔抗Caspase-3、DHE熒光探針購自碧云天、DCFH-DA 熒光探針購自Sigma Aldrich 公司。H9c2 由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及H/R 模型建立

H9c2 心肌細(xì)胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織，在37 ℃、5% CO2條 件 下 培 養(yǎng) 于 含10% 胎 牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中。對照組為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，缺氧組給予終濃度600 μ mol/L CoCl2的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行化學(xué)模擬缺氧16 h，H/R 組細(xì)胞在模擬缺氧后，換不含CoCl2DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.3 細(xì)胞存活率檢測

H9c2 心肌細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔的80% 面積時，根據(jù)實驗要求進(jìn)行處理：（1）設(shè)置CoCl2濃度梯度（0、150、300、450、600、900、1 200、2 400 μ mol/L）培 養(yǎng)24 h；（2）設(shè)置時間梯度（空白、4、12、16、24、48 h）600 μ mol/L CoCl2培養(yǎng)，每組設(shè)5 個復(fù)孔。上述過程完成后，每孔加10% MTT 200 μ L，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加DMSO 150 μ L，震蕩10 min，最后酶標(biāo)儀（λ=490 nm）下檢測吸光度（OD 值）。取6 孔OD 值的平均數(shù)，按公式計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）= OD 處理組/OD 對照組×100%，重復(fù)3 次。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的測定

將賴氨酸包被的蓋玻片置于6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，H9c2 心肌細(xì)胞被均勻的接種在蓋玻片上。當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔約80% 面積時，根據(jù)實驗需要給予相應(yīng)的處理：（1）缺氧組600 μ mol/L CoCl2分別處理8、16 h；（2）H/R 組：600 μ mol/L CoCl2分別處理8、16 h 后，換用不含CoCl2DMEM 培養(yǎng)4 h。每組包括3 個復(fù)孔，處理完后，用PBS 漂洗2 次，分 別 對H9c2 心 肌 細(xì) 用10 μ mol/L 綠 色 熒 光探針DCFH-DA 檢測缺氧8 h/復(fù)氧4 h、5 μ mol/L 紅色熒光探針DHE 檢測缺氧16 h/復(fù)氧4 h，37 ℃孵育30 min。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個不重復(fù)區(qū)攝片，用Image J1.42q 軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度（mean flourscence indensity，MFI）分析。

1.5 Western blot 法檢測p-p38、p-ERK1/2、p-JNK、Caspase-3 表達(dá)

H9c2 心肌細(xì)胞接種于35 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)至80% 滿時，分別按上述處理條件處理對照組、缺氧組及H/R 組細(xì)胞，處理各組細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS 洗2 次，加入細(xì)胞裂解液，裂解數(shù)分鐘后，12 000 r/min 離心10 min，取上清，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 測定蛋白含量?？偟鞍捉?jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用2% 胎牛血清蛋白封閉2 h，TBS洗3 次，隨后加入一抗p-JNK（1∶500）、p-ERK1/2（1∶500）、p-p38（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、α-Tubulin（1∶1 000）4 ℃過 夜，TBST 洗3 次 后 用HRP 標(biāo)記山羊抗兔（1∶5 000）37 ℃孵育1 h，TBST洗PVDF 膜3 次，用發(fā)光試劑ECL 顯色，暗室曝光到X 光片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

全部實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有結(jié)果以（±s)表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗，用LSD進(jìn)行均數(shù)之間的比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CoCl2呈濃度依賴性及時間依賴性抑制H9c2 心肌細(xì)胞成活率

圖1A 及表1 顯示，與對照組相比，不同濃度的CoCl2處 理H9c2 心 肌 細(xì) 胞16 h 后，150 μ mol/L CoCl2對H9c2 心 肌 細(xì) 胞 活 力 無 影 響，從300 μ mol/L 開始呈劑量依賴性抑制心肌細(xì)胞活力（P<0.01）。與 前 一 梯 度 濃 度 相 比，在600 μ mol/L 處下降最為明顯（P<0.001），隨后1200 μ mol/L 與900 μ mol/L、2 400 μ mol/L 與1 200 μ mol/L 細(xì)胞活力差別無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與細(xì)胞處于生長對數(shù)期抵制CoCl2毒性作用有關(guān)。圖1B 及表2 顯示不同時間段（0～48 h）下，與對照組相比，300、600 及2400 μ mol/L 的CoCl2均 呈 時 間 依 賴 性 抑 制H9c2 心肌 細(xì) 胞 活 力（P<0.01），其 中300、600 μ mol/L 在12～24 h 內(nèi)細(xì)胞活力差別無統(tǒng)計學(xué)意義，24 h 后顯著下降（P<0.001），而2 400 μ mol/L 的CoCl2除12～16 h 外細(xì)胞活力差別均存在顯著差異（P<0.001）。綜上，為有效抑制細(xì)胞活力并減少細(xì)胞過 多 的 凋 亡，選 擇600 μ mol/L 的CoCl2培 養(yǎng)16 h。

圖1 CoCl2對H9c2 心肌細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Effect of CoCl2 on H9c2 viability

表1 不同濃度CoCl2 處理16 h 對H9c2 心肌細(xì)胞存活率的影響（±s）Tab 1 Effect of different concentrations of CoCl2 for 16 h on survival rate of H9c2（±s）

表1 不同濃度CoCl2 處理16 h 對H9c2 心肌細(xì)胞存活率的影響（±s）Tab 1 Effect of different concentrations of CoCl2 for 16 h on survival rate of H9c2（±s）

OD 值OD CoCl2(μmol/L)0 100.0±4.5 t P--150 98.1±6.8 1.47 0.265 300 87.8±6.9 12.92 0.005 450 74.5±4.8 90.68<0.001 600 38.2±3.1 771.76<0.001 900 26.3±2.2 1 309.00<0.001 1 200 22.2±2.5 1 380.00<0.001 2 400 19.0± 2.5 1 491.00<0.001

表2 300、600 及2 400 μmol/L CoCl2時在不同時間段對H9c2 心肌細(xì)胞存活率的影響（%，±s）Tab 2 Effects of CoCl2 at 300，600 and 2 400 μmol/L on survival rate of H9c2 cardiomyocytes at different times（%，±s）

表2 300、600 及2 400 μmol/L CoCl2時在不同時間段對H9c2 心肌細(xì)胞存活率的影響（%，±s）Tab 2 Effects of CoCl2 at 300，600 and 2 400 μmol/L on survival rate of H9c2 cardiomyocytes at different times（%，±s）

組別300 μmol/L CoCl2 組600 μmol/L CoCl2 組2 400 μmol/L CoCl2 組0 h 99±2.2 100±4.5 100±3.3 4 h 80.5±6.7 44.2±8.2 36.6±4.8 12 h 63.4±0.3 40.1±2.5 26.7±3.3 16 h 60.9±0.9 35.3±1.7 24.9±3.3 24 h 59.8±2.7 33.5±9.6 15.8±1.1 48 h 51.3±0.8 19.6±0.9 9.8±0.8 F P 20.17 632.00 286.00<0.001<0.001<0.001

2.2 ROS 水平與H9c2 心肌細(xì)胞 缺氧、H/R 關(guān)系

圖2 顯 示 了ROS 熒 光 探 針 檢 測600 μ mol/L的CoCl2不同時間處理下H9c2 心肌細(xì)胞缺氧、缺氧/復(fù)ROS 水平變化。與對照組相比，缺氧4 h后采用DCFH-DA 活性氧探針MFI 為其1.9 倍（P<0.05），缺氧4 h/復(fù)氧4 h 后MFI 為 其4.2 倍（P<0.001）；缺氧16 h 后采用DHE 超氧化物陰離子熒光探針MFI 為其1.6 倍（P<0.0 1），缺氧1 6 h/復(fù)氧4 h MFI 為其2.5 倍（P<0.001）；缺氧4 h 或16 h 后復(fù)氧均可使ROS 水平產(chǎn)生進(jìn)一步增多（P<0.01），見表3。DCFH-DA 和DHE 探針法檢測結(jié)果表明CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)性缺氧劑可導(dǎo)致H9c2 心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高，去除CoCl2后模擬缺氧復(fù)氧環(huán)境仍可促進(jìn)ROS 表達(dá)。

圖2 缺氧、H/R 對H9c2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig 2 Effect of hypoxia and hypoxia/reoxygenation on ROS in H9c2

2.3 缺氧、H/R 下H9c2 心肌細(xì)胞內(nèi)p-JNK、p-ERK1/2 和p-p38 蛋白表達(dá)影響

結(jié) 果 顯 示H9c2 心 肌 細(xì) 胞 在600 μ mol/L 的CoCl2誘 導(dǎo) 缺 氧16 h，復(fù) 氧4 h 時p-MAPKs 活 性變化。蛋白印跡檢測顯示，與對照組比較，p-JNK和p-p38 表達(dá)升高（P<0.05），而p-ERK 變化無統(tǒng)計 學(xué) 意 義，提 示600 μ mol/L 的CoCl2誘 導(dǎo) 缺 氧16 h 后 可 引 起p-JNK 和p-p38 明 顯 升 高，而p-ERK 無明顯變化，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生H/R 后，與缺氧組比較，三者均明顯升高（P<0.01），提示細(xì)胞H/R 加重細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步活化p-MAPKs，見圖3，表4。

表3 缺氧、H/R 對H9c2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響（±s）Tab 3 Effect of hypoxia and hypoxia/reoxygenation on ROS in H9c2（±s）

表3 缺氧、H/R 對H9c2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響（±s）Tab 3 Effect of hypoxia and hypoxia/reoxygenation on ROS in H9c2（±s）

注：與對照組比較,*P<0.05；與缺氧組比較，##P<0.01。

組別DHE（16 h）對照組缺氧組H/R 組DCFH-DA（4 h）0.035±0.006 0.068±0.015 0.147±0.034 P -P -0.001*<0.001##0.038*<0.001##0.022±0.005 0.036±0.003 0.054±0.006

2.4 H9c2 心肌細(xì)胞缺氧、H/R 時對Cleaved Caspase-3 活性的影響

圖4 為H9c2 細(xì) 胞 在600 μ mol/L 的CoCl2誘 導(dǎo)缺氧16 h，復(fù)氧4 h 下細(xì)胞凋亡情況。圖中無活性Caspase-3 在缺氧、H/R 逐漸減少，轉(zhuǎn)化為有活性的Cleaved Caspase-3 并逐漸增多。從結(jié)果中可看出細(xì)胞缺氧下可激活Caspase-3 介導(dǎo)的凋亡通路，H/R 后可使該通路進(jìn)一步活化，見表5。

圖3 缺氧、H/R 下H9c2 細(xì)胞內(nèi)p-JNK、p-ERK 及p-p38 表達(dá)變化Fig 3 Effect of hypoxia and hypoxia/reoxygenation on p-JNK，p-ERK and p-p38 in H9c2

表4 缺氧、H/R 下H9c2 細(xì)胞內(nèi)p-JNK、p-ERK 及p-p38 表達(dá)變化（±s）Tab 4 Effects of hypoxia and hypoxia/reoxygenation on p-JNK，p-ERK and p-p38 in H9c2（±s）

表4 缺氧、H/R 下H9c2 細(xì)胞內(nèi)p-JNK、p-ERK 及p-p38 表達(dá)變化（±s）Tab 4 Effects of hypoxia and hypoxia/reoxygenation on p-JNK，p-ERK and p-p38 in H9c2（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與缺氧組比較，##P<0.01。

組別對照組缺氧組H/R 組P-JNK 1.323±0.041 1.559±0.075 2.068±0.070 P-P-P-0.014*<0.001##0.026*<0.001##P-ERK 0.507±0.069 0.524±0.067 0.771±0.066 0.793*0.005##P-P38 0.946±0.024 1.282±0.167 1.914±0.076

圖4 缺氧、H/R 下對H9c2 細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 活性裂解片段表達(dá)的影響Fig 4 Effects of hypoxia and hypoxia/reoxygenation on the expression of cleaved Caspase-3 in H9c2

表5 缺氧、H/R 下對H9c2 細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 活性裂解片段表達(dá)的影響（±s）Tab 5 Effects of hypoxia and hypoxia/reoxygenation on the expression of cleaved Caspase-3 in H9c2（±s）

表5 缺氧、H/R 下對H9c2 細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 活性裂解片段表達(dá)的影響（±s）Tab 5 Effects of hypoxia and hypoxia/reoxygenation on the expression of cleaved Caspase-3 in H9c2（±s）

組別對照組缺氧組H/R 組Caspase-3 活性裂解片段0.056±0.018 0.307±0.109 0.731±0.173 P-0.041*<0.001##

3 討論

H9c2 細(xì)胞株來源于大鼠胚胎心臟組織，具有成熟心肌細(xì)胞特性，廣泛用于細(xì)胞形態(tài)、電生理及毒理研究［5］。細(xì)胞體外H/R 模型可通過物理性及化學(xué)性誘導(dǎo)。物理性缺氧常在充有氮氣缺氧裝置及常氧裝置中完成［6］，因需要嚴(yán)格檢測氧濃度，技術(shù)性要求高所以其運用受到限制?；瘜W(xué)性缺氧則操作方便，CoCl2為常用的是化學(xué)性低氧模擬劑。鈷可替代亞鐵螯合于血紅蛋白中，使細(xì)胞攝氧障礙而引起氧化應(yīng)激損傷，去除CoCl2溶液換用新鮮培養(yǎng)基可恢復(fù)血紅蛋白攝氧，引起細(xì)胞H/R 損傷［7］，進(jìn)而模擬細(xì)胞I/R 損傷。本實驗再次證實，CoCl2呈濃度依賴性及時間依賴 性 抑 制H9c2 心 肌 細(xì) 胞 成 活 率，與Gallo 等［8］報道的相一致。本研究顯示心肌細(xì)胞缺氧后可導(dǎo)致ROS 大量產(chǎn)生，而H/R 后ROS 進(jìn)一步增多，進(jìn)而證實心肌I/R 損傷與ROS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。細(xì)胞經(jīng)I/R 處理后產(chǎn)生的ROS可作為第二信使從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運到胞漿，并作為第三信使轉(zhuǎn)進(jìn)入細(xì)胞核中，通過與DNA 結(jié)合及改變下游基因表達(dá)水平引起細(xì)胞I/R 損傷，因而目前常用的抗氧化劑如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、輔酶Ⅱ和血紅素加氧酶-1，可減少細(xì)胞內(nèi)ROS 水平達(dá)到抗氧化應(yīng)激損傷作用［9］。

H9c2 在H/R 誘導(dǎo)下通過ROS/JNK/Egr-1 通路引發(fā)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷［10］，而腺苷酸活化蛋白激酶的激活可通過JNK 介導(dǎo)的NF-κ B 途徑抑制缺氧/復(fù)氧時的炎癥反應(yīng)［11］。H9c2 細(xì)胞凋 亡 與ROS 激 活JNK/p38 通 路 有 關(guān)，Jantira 等［12］證實使用P38 抑制劑可阻斷P38 通路進(jìn)而對糖尿病缺血性心肌病患者起到積極的心臟保護(hù)作用。P38 通路在細(xì)胞缺血缺氧時可被活化，但并不是出現(xiàn)在所有缺血缺氧模型中，這與細(xì)胞何時被激活以及缺血持續(xù)時間密切相關(guān)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，H9c2 在缺氧及H/R 不同處理后JNK 和p38 磷酸化水平均明顯升高，而p-ERK 在缺氧處理后升高不明顯，但經(jīng)H/R 后表達(dá)水平明顯升高，這 與Mizukanmi 等［14］在 對 大 鼠 心 臟I/R 體 內(nèi)實驗結(jié)果相一致，該研究發(fā)現(xiàn)缺血不足以激活ERK 上 游 分 子MEK（MAP kinase/extracellular signal-regulatedkinase kinase）-2，只有經(jīng)I/R 處理后可使得MEK-2 磷酸化進(jìn)而激活ERK。此外，是否需ROS 大量蓄積后才能激活ERK 通路尚需要進(jìn)一步證實。總之，MAPKs 通路的活化隨著ROS不同誘導(dǎo)條件而存在差異，提示三條通路不是獨立存在，而是相互作用、相互影響。

在缺氧或H/R 條件下產(chǎn)生的ROS 可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，主要表現(xiàn)在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、溶酶體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，可分別通過JNK/ERK/p38 通路介導(dǎo)下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15-17］，本課題組既往研究對此有詳細(xì)闡釋［18］。本研究進(jìn)一步證實H9c2 經(jīng)I/R 損傷后可引發(fā)更多的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。目前ERK 信號通路在細(xì)胞凋亡中的作用存在爭論，該通路活化既可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡［19］，也可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡使其存活的 作 用［20］。龐 偉［21］同 樣 證 實 在 缺 鋅 致 海 馬 神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中發(fā)現(xiàn)ERK 活性表達(dá)下降，引發(fā)細(xì)胞凋亡，而適量補(bǔ)鋅可通過活化MEK/ERK 信號通路，減緩海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷。JNK、ERK 及p38 在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。綜上所述，CoCl2誘導(dǎo)缺氧、H/R 損傷模型，可模擬心肌細(xì)胞缺血、I/R 損傷病理過程，為后續(xù)抗氧化應(yīng)激損傷機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。