薩喆燕，朱小香，萬(wàn) 隆，潘曉華，蘭彩蓮，許金森

（福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003）

《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》數(shù)據(jù)顯示，目前我國(guó)冠心病的防治形勢(shì)相當(dāng)嚴(yán)峻，約有冠心病患者1 100萬(wàn)，且患病率不斷上升［1］。冠心病是一種復(fù)雜的“廣譜性”疾病，癥狀可表現(xiàn)為無(wú)癥狀性冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變到心臟性猝死不等［2］，發(fā)病機(jī)制主要為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起血管腔痙攣或狹窄，導(dǎo)致心肌缺血缺氧壞死。中醫(yī)針灸治療冠心病具有悠久的歷史，現(xiàn)代臨床實(shí)踐也證明針刺能明顯改善冠心病患者血脂、血壓、心率等指標(biāo)，減少冠狀動(dòng)脈斑塊的形成［3］；循經(jīng)取穴針刺還可顯著減少病患心絞痛發(fā)作次數(shù)，減輕心絞痛發(fā)作程度，改善冠心病患者的生活質(zhì)量［4］。雖然針刺治療冠心病改善心肌缺血的療效明確，但其機(jī)制仍有待進(jìn)一步明晰。

研究發(fā)現(xiàn)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angioten‐sin system，RAS）在冠心病發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色［5］。RAS 成員主要包括血管緊張素原（angio‐tensinogen，AGT）、腎素（renin，Ren）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，Ace）、血管緊張素（angiotensin，Ang）及血管緊張素受體等［6］。AGT作為RAS 的唯一前體物質(zhì)，不僅與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，也是影響冠心病進(jìn)程的重要因子［7］。目前，有關(guān)針刺治療心肌缺血過程中心肌組織AGT 的變化鮮有報(bào)道。本研究以心肌缺血大鼠為模型，觀察循經(jīng)取穴電針對(duì)大鼠心肌缺血的改善程度及對(duì)AGT 基因表達(dá)的影響，探討針刺改善心肌缺血的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SD 雄性大鼠28只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（250±20）g，由福建省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（閩）2012-0001。實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）、Trizol Re‐agent（美國(guó)Sigma 公司），熒光定量PCR 試劑盒（日本TakaRa 公司），引物設(shè)計(jì)與合成（上海康成生物工程有限公司）；小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)（深圳瑞沃德公司，型號(hào)：R407），多導(dǎo)生理記錄儀（澳大利亞埃德公司，型號(hào)：Powerlab 8/30），-80 ℃超低溫冰箱（海爾公司，型號(hào)：DW-86L626），高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司，型號(hào)：Allegra 64R），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI公司，型號(hào)：7500）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法與分組

28只SD 大鼠隨機(jī)分成4組，即生理鹽水對(duì)照組、模型組、電針內(nèi)關(guān)穴組、電針非經(jīng)非穴組，每組各7只。連接小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)，大鼠通過呼吸面罩持續(xù)吸入異氟烷麻醉，用多導(dǎo)生理記錄儀采集動(dòng)態(tài)大鼠心電圖。模型組、電針內(nèi)關(guān)穴組和電針非經(jīng)非穴組大鼠注射ISO 造成心肌缺血，具體方法：大鼠仰臥位固定，分別在四肢內(nèi)側(cè)根部及背部皮下注射ISO（85 mg/kg），共注射2 次，前后間隔24 h。當(dāng)心電圖出現(xiàn)ST 段抬高，T 波由正向變?yōu)樨?fù)向或出現(xiàn)M 波時(shí)確認(rèn)造模成功。對(duì)照組大鼠在四肢內(nèi)側(cè)根部及背部皮下注射生理鹽水（85 mg/kg），共注射2次，前后間隔24 h。

1.4 針刺與選穴

參考李忠仁的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，內(nèi)關(guān)穴定位于大鼠左前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm 尺橈骨縫間［8］。非經(jīng)非穴選取大鼠左側(cè)臀大肌外上象限內(nèi)無(wú)穴位和經(jīng)絡(luò)處［9］。針刺方法：選用0.25 mm×13 mm 無(wú)菌毫針，直刺0.1 cm，并連至SDZ-Ⅱ華佗牌電針儀。電針參數(shù)：疏密波，頻率2/10 Hz，強(qiáng)度以針體輕微抖動(dòng)為度，連續(xù)電針20 min。于第二次注射ISO 后24 h 開始電針，每天1 次，連續(xù)5 d。模型組和對(duì)照組均不予電針，僅每天同等條件抓取1次。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 心指數(shù)檢測(cè) 最后一次電針前稱取大鼠體質(zhì)量。最后一次電針后處死大鼠，迅速取出心臟，4 ℃預(yù)冷生理鹽水洗凈殘血，吸干水分，電子天平稱取全心質(zhì)量，心指數(shù)（%）=全心質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.5.2 病理學(xué)切片檢測(cè) 切取大鼠左心室，常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片，行HE 染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞病理改變。

1.5.3 基因芯片檢測(cè)心肌RAS 相關(guān)基因 大鼠處死后立即采集新鮮左心室組織，保存于-80 ℃超低溫冰箱。模型組和電針內(nèi)關(guān)穴組各隨機(jī)選取3 個(gè)樣品，由上?？党缮锕こ逃邢薰具M(jìn)行基因芯片檢測(cè)。芯片為大鼠LncRNA v2.0 芯片，可同時(shí)檢測(cè)LncRNAs 和mRNA。步驟：Trizol 法提取心肌組織總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度和純度；1% 變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下檢測(cè)RNA 完整性；從總RNA 中得到mRNA，轉(zhuǎn)錄成含熒光標(biāo)記的cRNA；將標(biāo)記好的cRNAs 進(jìn)行芯片雜交、洗滌、固定；掃描芯片，通過軟件得到探針信號(hào)值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)過歸一化處理和分析，得到模型組和電針內(nèi)關(guān)穴組標(biāo)記RAS 相關(guān)基因的差異倍數(shù)，經(jīng)過t 檢驗(yàn)，按照倍數(shù)≥1.5，P<0.05 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。對(duì)差異表達(dá)的mRNA 進(jìn)行基因本體GO 分析，尋找AGT 參與的表達(dá)異常的mRNA 相關(guān)的生物學(xué)過程。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)心肌組織AGT mRNA 表達(dá) 干預(yù)結(jié)束后處死大鼠，分別取生理鹽水對(duì)照組、模型組、電針內(nèi)關(guān)穴組、電針非經(jīng)非穴組等4 組大鼠左心室組織，-80 ℃保存。主要步驟：Trizol 法提取心肌組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)各組心肌組織AGT mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，引物見表1。AGT mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得，GAPDH 為內(nèi)參，生理鹽水對(duì)照組為1。

表1 RT-PCR 引物序列Tab 1 RT-PCR primer sequences

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心指數(shù)變化

與生理鹽水對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著減輕，心指數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.01）；與模型組比較，電針內(nèi)關(guān)穴組大鼠體質(zhì)量明顯增加，心指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）；電針非經(jīng)非穴組大鼠體質(zhì)量、心指數(shù)與模型組比較無(wú)明顯變化，而較電針內(nèi)關(guān)穴組差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。見表2。

2.2 各組大鼠HE 染色比較

光鏡下可見生理鹽水對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組和電針非經(jīng)非穴組大鼠心肌組織中均可見心肌纖維大量壞死溶解，被增生的結(jié)締組織替代（圖1黑色箭頭），伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；電針內(nèi)關(guān)穴組大鼠心肌細(xì)胞間隙增寬，也可見少量結(jié)締組織增生，但其病灶范圍明顯小于模型組和電針非經(jīng)非穴組。見圖1。

表2 各組大鼠體質(zhì)量和心指數(shù)比較（±s)Tab 2 Comparison of weight and heart index（±s)

表2 各組大鼠體質(zhì)量和心指數(shù)比較（±s)Tab 2 Comparison of weight and heart index（±s)

心指數(shù)（%）0.28±0.01 0.37±0.01**0.32±0.02#0.40±0.02△△15.921<0.001組別生理鹽水對(duì)照組模型組電針內(nèi)關(guān)穴組電針非經(jīng)非穴組n 7 7 7 7 FP體質(zhì)量（mg）294.86±3.45 274.64±2.36**286.36±2.52##268.36±2.50△△18.644<0.001

2.3 基因芯片檢測(cè)RAS 相關(guān)基因的變化

芯片信號(hào)經(jīng)過歸一化處理，并根據(jù)不同樣品間RAS相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的不同進(jìn)行分層聚類分析，表達(dá)程度越相似的樣品更容易聚類在一起，且顏色越接近紅色代表表達(dá)水平越高，顏色越接近綠色代表表達(dá)水平越低。見圖2。結(jié)果顯示心肌AGT 基因在組間表達(dá)趨勢(shì)最為一致，差異也最為顯著，即在模型組各大鼠心肌組織中均高表達(dá)，在電針內(nèi)關(guān)穴組各大鼠心肌組織中表達(dá)均下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為2.16，且P<0.05；其余各基因表達(dá)變化不一致，差異不顯著，變化倍數(shù)小于1.5。見表3。

2.4 GO 分析

GO 分析顯示差異表達(dá)的mRNA 參與的生物過程，圖3、表4 列出AGT 參與的富集分?jǐn)?shù)最高的前10條生物過程。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化（×400）Fig 1 Morphological changes of myocardial tissue（×400）

圖2 電針內(nèi)關(guān)組和模型組RAS 相關(guān)基因表達(dá)的聚類熱圖Fig 2 Clustering heat map of RAS-related gene expression between the EA group and the model group

表3 基因芯片檢測(cè)RAS 相關(guān)基因的變化倍數(shù)（電針內(nèi)關(guān)穴組vs 模型組）Tab 3 Change of RAS-related genes detected by gene chip（the EA group vs the model group）

2.5 心肌組織AGT mRNA 表達(dá)比較

與生理鹽水對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織AGT mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相較，電針內(nèi)關(guān)穴組大鼠心肌組織AGT mRNA 表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；電針非經(jīng)非穴組大鼠心肌組織AGT mRNA 表達(dá)量與模型組相較無(wú)差異，而與電針內(nèi)關(guān)穴組相較，則顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表5。

圖3 AGT 參與的通路富集分析Fig 3 Enrichment analysis of pathway

表4 AGT 參與相關(guān)生物過程GO 條目Tab 4 GO analysis result of biological process

表5 各組大鼠心肌組織AGT mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s)Tab 5 Comparison of relative expression levels of AGT mRNA in myocardial tissue（±s)

表5 各組大鼠心肌組織AGT mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s)Tab 5 Comparison of relative expression levels of AGT mRNA in myocardial tissue（±s)

AGT mRNA 1.00±0.13 4.46±1.28**1.45±0.35##4.11±0.86△△5.035<0.01組別生理鹽水對(duì)照組模型組電針內(nèi)關(guān)穴組電針非經(jīng)非穴組n 7 7 7 7 FP

3 討論

本實(shí)驗(yàn)使用皮下注射ISO 制備心肌缺血大鼠模型。ISO 是一種強(qiáng)β 腎上腺素能受體激動(dòng)劑，可通過增快心率、增強(qiáng)心肌收縮力，從而加大心肌耗氧量、增大心臟負(fù)荷，最終導(dǎo)致心肌缺血缺氧壞死［10］。由于ISO 導(dǎo)致的心臟負(fù)荷增加以及血液供應(yīng)和組織需氧量之間的失衡是心肌缺血壞死進(jìn)程中的重要因素，且從組織結(jié)構(gòu)角度很難將其與冠狀動(dòng)脈狹窄引起的局部缺血區(qū)分開來(lái)，因此ISO 誘導(dǎo)的心肌缺血模型常作為心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ停?1］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ISO 注射后模型大鼠體重明顯減輕，心指數(shù)顯著增加；病理組織可見心肌纖維大量壞死溶解，壞死組織被大量增生的結(jié)締組織代替，這提示ISO 注射成功誘導(dǎo)了心肌缺血，心肌缺血大鼠模型建立成功。

ISO 誘導(dǎo)的心肌缺血損傷與其激活RAS有關(guān)［11］。RAS作為機(jī)體關(guān)鍵的內(nèi)分泌系統(tǒng)，不僅存在于循環(huán)系統(tǒng)之中，還存在于心、腎、腦等多個(gè)組織器官中，主要通過調(diào)節(jié)血壓和電解質(zhì)平衡發(fā)揮重要生理、病理功能［12-14］。在經(jīng)典RAS 中，腎素催化AGT 形成血管緊張素Ⅰ，隨后通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶將其轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺血心肌組織中AGT、腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、血管緊張素等RAS相關(guān)基因均有表達(dá)，且電針內(nèi)關(guān)穴組與模型組間表達(dá)有差異。變化趨勢(shì)、差異倍數(shù)和顯著性分析結(jié)果均表明AGT 基因差異表達(dá)最為顯著。

AGT 作為RAS 的唯一前體物質(zhì)，通常被認(rèn)為是被動(dòng)的RAS 底物，但隨著研究的深入，更多證據(jù)表明AGT 具有調(diào)節(jié)腎臟功能、影響血管生成、脂肪擴(kuò)張等生物學(xué)特性［15，16］。本實(shí)驗(yàn)通過GO 分析也發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)AGT 參與了多個(gè)生物過程，主要包括細(xì)胞活化、多細(xì)胞生物過程的調(diào)控、應(yīng)激的調(diào)控、防御反應(yīng)的調(diào)控、細(xì)胞因子的生成等信號(hào)通路，由此可見AGT 的調(diào)控與功能的復(fù)雜性。

針灸療效產(chǎn)生的關(guān)鍵在于其作用于特定經(jīng)絡(luò)、特定腧穴產(chǎn)生的特定效應(yīng)［17］。本實(shí)驗(yàn)遵循“經(jīng)脈所過，主治所及”，循經(jīng)選擇心包經(jīng)內(nèi)關(guān)穴治療心肌缺血。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組與電針非經(jīng)非穴組比較，大鼠心指數(shù)、病理結(jié)構(gòu)無(wú)明顯區(qū)別，而電針內(nèi)關(guān)穴組大鼠心指數(shù)較模型組、電針非經(jīng)非穴組均明顯降低，其缺血壞死病灶范圍也明顯縮小，提示循經(jīng)取穴電針改善了大鼠心肌缺血程度。同時(shí)，心肌缺血大鼠心肌AGT mRNA 表達(dá)量顯著增加；電針內(nèi)關(guān)穴可降低心肌缺血大鼠心肌AGT mRNA 表達(dá)水平；而電針非經(jīng)非穴對(duì)心肌AGT mRNA 表達(dá)水平無(wú)顯著影響。

有研究表明AGT 是影響冠心病進(jìn)程的重要因子［7］。AGT 基因多態(tài)性可增加冠心病的患病率，影響急性心肌梗死患者的死亡率和生存預(yù)后［18-20］。AGT還與心肌組織纖維化相關(guān)。心肌AGT 表達(dá)增強(qiáng)，可活化RAS，促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)，導(dǎo)致心肌纖維化［21］；血管活性腸肽物質(zhì)可通過影響RAS 中AGT 和血管緊張素受體AT1a的表達(dá)，改善心肌纖維化的程度［22］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，循經(jīng)取穴電針可能通過抑制心肌AGT mRNA 的表達(dá)，減輕心肌纖維化，進(jìn)而改善心肌缺血狀態(tài)。當(dāng)然，由于針刺干預(yù)機(jī)制復(fù)雜多樣，非單一因素決定，因此電針改善心肌缺血的機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入。