張穎 季策 任建峰 李偉眀 張慶華*

1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306 2.上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫，上海 201306 3.密歇根州立大學(xué)漁業(yè)與野生生物系，東蘭辛，48824

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種因骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病(世界衛(wèi)生組織，WHO)[1]。Notch信號通路在包括哺乳動物在內(nèi)的多個物種中表達(dá)，對器官、組織的發(fā)育過程起調(diào)控作用，可調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化及凋亡等過程[2]。Notch信號通過受體和相鄰細(xì)胞的特異性配體結(jié)合，經(jīng)2次酶解后釋放胞內(nèi)段(Notch intracellular domain，NICD)激活Notch信號通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[3]。國內(nèi)、外研究證實(shí)Notch信號通路將直接作用于成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的增殖和分化，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮了重要的調(diào)控功能[4]。

Notch信號通路和蛋白激酶A(protein kinase A，pka)參與的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路相輔相成，在生物進(jìn)化的過程中發(fā)揮著重要的作用。Notch信號通路在髓核內(nèi)的表達(dá)和活化依賴于其與MAPK和核轉(zhuǎn)錄因子kappa B信號通路的交互作用，進(jìn)而調(diào)控著髓核細(xì)胞增殖、分化[5]。有研究[6]表明，MAPK信號通路和Notch信號通路相互聯(lián)系，共同調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSCs)成骨分化過程。

pka在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSCs)成骨分化方面有著很強(qiáng)的能力。pka活性的增強(qiáng)能夠促進(jìn)成骨分化的基因，抑制破骨基因的表達(dá)，從而降低骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[7]。一些研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞中環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)/PKA途徑的激活導(dǎo)致NF-κB配體(kappa nuclear factor receptor)與骨保護(hù)素(osteoprotegerin)的比例降低，抑制破骨細(xì)胞生成[8]。PKA可以被甲狀腺激素(parathyroid hormone, PTH)誘導(dǎo)激活，進(jìn)而導(dǎo)致cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein, CREB)磷酸化并激活，從而導(dǎo)致NF-κB配體(kappa nuclear factor receptor，RANKL)的生成[9]。縱觀Notch分子通路影響多個基因調(diào)控骨骼的形成和發(fā)展機(jī)制為我們認(rèn)識有關(guān)骨骼疾病的分子機(jī)制奠定了很好的基礎(chǔ)，但目前關(guān)于Notch信號是否通過調(diào)控pka來影響骨骼的形成并不清楚，因此我們推測Notch信號通路可能通過調(diào)控pka進(jìn)而影響骨細(xì)胞的成熟與分化。

在骨骼研究領(lǐng)域人們已經(jīng)成功建立了許多動物骨骼模型，而新型模式生物斑馬魚則越來越受到人們的關(guān)注[10]。成年斑馬魚骨屬性與人類相似，目前已復(fù)制出數(shù)個成年魚骨病(如骨質(zhì)疏松)模型，用于分析病理生理機(jī)制和設(shè)計(jì)新的治療方案。在細(xì)胞水平上，斑馬魚的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞與哺乳動物高度相似。因此，胚胎斑馬魚已被廣泛應(yīng)用于骨組織的發(fā)育研究[11]。成年斑馬魚骨質(zhì)疏松模型具有易飼養(yǎng)、成本低；給藥方法簡便，給藥濃度可控；大幅度縮短造模及給藥干預(yù)時間，提高研究效率；分子機(jī)制也與人類高度相似的特點(diǎn)。此外，斑馬魚的notch1a基因與哺乳動物的notch1高度相似。本研究以斑馬魚為模型，利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)探究notch1a的胞內(nèi)段(N1aICD)與pka基因的調(diào)控關(guān)系，將有助于闡明骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)用魚：實(shí)驗(yàn)AB品系斑馬魚購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所斑馬魚平臺。

1.1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)所用HEK293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)由中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)曹雪濤教授惠贈。

1.1.3主要試劑：熒光素酶報告基因載體pGL3-Enhancer由中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)曹雪濤教授惠贈，DMEM培養(yǎng)基(HyClone，AD24464275)，Opti-MEM(gibco，1894141)，轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD Transfection Reagent(Promega，0000352595)，Dual Luciferase Reporter(REASEN，D4901060)，哺乳動物表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-7(SIGMA)，同源重組試劑2×ClonExpress Mix(諾唯贊，C115-02-AA)，小鼠抗FLAG-tag單克隆抗體(YSASEN，30503ES60)，Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP(Invitrogen，31430)，β-actin, Rabbit pAb(YSASEN，30102ES40)，Peroxidase- Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(YSASEN，33101ES60)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1斑馬魚pka啟動子序列的獲得以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的分析：運(yùn)用在線工具UCSC Genome Browse(http://www. genome.ucsc.edu)預(yù)測pka啟動子序列。通過AliBaba(http://gene-regulation.com/pub /programs/alibaba2/index.html)分析轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，通過Methprimer-Design(http://www. urogene.org /cgi-bin/ methprimer/methprimer.cgi)和EMBOSS Cpgplot(https://www.ebi.ac.uk /Tools/ seqstats /emboss cpgplot/)預(yù)測啟動子的CpG島。

1.2.2斑馬魚pka熒光素酶報告基因載體構(gòu)建：根據(jù)啟動子的序列設(shè)計(jì)的引物，F(xiàn)orward：GTCGCCGTCCTCGTTCTAT，Reverse：AACCAG CCAACCAGCCTAG。以基因組DNA為模板，利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI對質(zhì)粒載體pGL3-Enhancer和PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，將其與PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。之后將二者用T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α中，測序并對其進(jìn)行鑒定。

1.2.3斑馬魚notch1a胞內(nèi)段(N1aICD)真核表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)NCBI網(wǎng)站上登錄的斑馬魚notch1a基因(NM_131441.1)設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)orward：GACAAGCTTGCATGCCTGCAGAACGAACCCAAAA AGAAGAGGA，Reverse：CAGGGATGCCACCCGGG ATCCCTACTTGAAGGCTTCTGGAATATGG。以斑馬魚cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和BamHⅠ對載體p3xFLAG-CMV-7進(jìn)行雙酶切并純化。純化之后用同源重組連接酶2×ClonExpress Mix將其與p3xFLAG-CMV-7相連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，測序并進(jìn)行鑒定。

1.2.4斑馬魚N1aICD的蛋白表達(dá)分析：將構(gòu)建好的pCMV-N1aICD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞并提取蛋白。用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，-20 ℃凍存。取25 μg進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至NC膜上，過夜封閉，PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以鼠源FLAG-tag抗體為一抗(1∶2 000倍稀釋)孵育3 h，之后PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以山羊抗鼠為二抗(1∶2 000倍稀釋)孵育3 h，再用PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，ECL顯色，發(fā)光，檢測分析Western blot結(jié)果。

1.2.5pka報告基因的活性檢測：HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于10 % FBS-DMEM培養(yǎng)液中。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70 %～80 %時即可轉(zhuǎn)染。參照轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD Transfection Reagent的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，之后按不同分組將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到HEK293T細(xì)胞中(表1)，24 h后檢測報告基因活性。

表1 pka報告基因表達(dá)活性檢測實(shí)驗(yàn)分組情況Table 1 Detection of pka promoter expression activity

1.2.6N1aICD對pka啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響：參照轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD Transfection Reagent的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，之后按不同分組將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到HEK293T細(xì)胞中(表2)，24 h后檢測熒光素酶活性。

表2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)分組情況

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用GraghPad Prism 6.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每組各設(shè)三個生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)，兩組之間采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pka轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的分析

AliBaba軟件分析啟動子上存在Oct-1、Oct-1 A、AP-1、HNF-1、E1、myogenin、MyoD、NF-kappaB、IK-1、IK-2等重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖1 A)。通過EMBOSS Cpgplot 和 Methprimer-Design軟件分析，沒有發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的CpG島(圖1B；1C)。

注：A AliBaba軟件預(yù)測的pka的5’調(diào)控序列的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；B EMBOSS Cpgplot軟件預(yù)測pka啟動子的CpG島；C：Methprimer-Design軟件預(yù)測pka啟動子的CpG島。圖1 斑馬魚pka啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和CPG島的預(yù)測Fig.1 Prediction of pka promoter transcription factor binding site and CpG island in zebrafish

2.2 pka報告基因載體的構(gòu)建

以斑馬魚的基因組為模板，克隆pka啟動子片段。電泳結(jié)果顯示，在約3 000 bp處出現(xiàn)單一條帶(圖2)。測序結(jié)果與預(yù)測信息比對一致后將PCR純化產(chǎn)物雙酶切，然后與雙酶切載體pGL3-Enhancer連接并測序檢驗(yàn)克隆成功。

圖2 pka啟動子的擴(kuò)增Fig.2 The promoter fragment of pka

2.3 N1aICD真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以斑馬魚的cDNA為模板，克隆notch1a基因的胞內(nèi)段，電泳結(jié)果顯示，在約2 000 bp處出現(xiàn)單一條帶(圖3 A)。將純化后的PCR產(chǎn)物與雙酶切載體p3xFLAG-CMV用同源重組的方式連接，并經(jīng)測序驗(yàn)證其與預(yù)測信息一致。

注：A notch1a基因的胞內(nèi)段擴(kuò)增；B Western blot通過Flag標(biāo)簽顯示了N1aICD蛋白的表達(dá)水平。圖3 notch1a基因的胞內(nèi)段擴(kuò)增與Western blot分析N1aICD蛋白的表達(dá)Fig.3 Intracellular amplification of notch1a and western blot analysis the expression of N1aICD

2.4 Western blot分析N1aICD蛋白的表達(dá)情況

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后成功表達(dá)N1aICD蛋白，我們進(jìn)行了Western blot分析。轉(zhuǎn)染pCMV-N1aICD質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組使用Flag抗體出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染p3×FLAG-CMV空載質(zhì)粒的對照組中卻未見相關(guān)條帶，表明實(shí)驗(yàn)組有N1aICD蛋白的表達(dá)(圖3B)。

2.5 pka報告基因的活性檢測

將pGL3-pka重組質(zhì)粒和pGL3-Enhancer空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后檢測啟動子活性。檢測結(jié)果顯示，在HEK293T細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組活性為對照組的3.25倍，兩組差異有顯著性意義(P=0.0009)(圖4)，說明構(gòu)建的報告基因在HEK293T細(xì)胞中具有一定活性。

圖4 重組質(zhì)粒pGL3-pka轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后熒光素酶相對表達(dá)量Fig.4 Luciferase relative expression of recombinant plasmid pGL3-pka after transfecting HEK293T

2.6 N1aICD對pka啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

pGL3-pka及pRL-CMV內(nèi)參質(zhì)粒和pCMV-N1aICD共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，對照組則轉(zhuǎn)染p3×FLAG-CMV空載。熒光素酶報告基因活性檢測顯示，實(shí)驗(yàn)組的熒光素酶活性是對照組的0.31倍，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0020)(圖5)，說明notch1a胞內(nèi)段對pka啟動子具有明顯的抑制作用。

圖5 在HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證N1aICD對pka啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響Fig.5 Verify the effect of N1aICD on the transcriptional activity of pka promoter in HEK293T cells

3 討論

骨骼生長和修復(fù)是通過骨重塑實(shí)現(xiàn)的，正常的骨重塑使骨量保持平衡，這基于骨形成和骨吸收過程之間的動態(tài)平衡[12]。斑馬魚骨質(zhì)疏松模型相比于其他模式生物具有特殊的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于骨骼發(fā)育及相關(guān)疾病機(jī)制的研究與治療[13]。然而因缺乏抗體和細(xì)胞系，在研究具體的分子機(jī)制方面仍存在瓶頸，因此以斑馬魚為研究模型找到一種簡單而又可行的方法，深入研究基因的功能就顯得格外重要。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)已成為研究轉(zhuǎn)錄因子參與基因調(diào)控的有效手段，可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。因此正確構(gòu)建報告基因系統(tǒng)可對目的基因所具備的功能及其所參與的信號通路提供有力的研究工具。

本研究利用AliBaba在線分析發(fā)現(xiàn)pka啟動子上存在Oct-1、Oct-1 A、AP-1、HNF-1、E1、myogenin、MyoD、NF-κB、IK-1、IK-2等重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。有研究證實(shí)AP-1在廢用性骨質(zhì)疏松破骨細(xì)胞分化方面有著重要影響[14]。

Notch信號通路和pka基因在骨細(xì)胞的分化和成熟中有著重要的作用。在成骨細(xì)胞分化方面，為了探究Notch信號通路對pka基因的調(diào)控作用，本文構(gòu)建了斑馬魚notch1a基因胞內(nèi)段的真核表達(dá)載體和pka啟動子的報告基因載體，為今后探究pka基因的表達(dá)調(diào)控提供了基礎(chǔ)，同時實(shí)驗(yàn)也通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明了斑馬魚N1aICD對pka基因的轉(zhuǎn)錄抑制效率達(dá)到69.44 %，初步揭示了Notch信號通路和pka之間的調(diào)控作用，并可能為探明不同信號途徑在骨吸收和骨形成中的相互作用提出新證據(jù)。

在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)Notch1通過直接作用于破骨細(xì)胞前體并間接作用于成骨細(xì)胞而抑制破骨細(xì)胞分化，破骨細(xì)胞前體中Notch1的基因缺失增強(qiáng)了破骨細(xì)胞生成。N1ICD在成骨細(xì)胞中的過度表達(dá)會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的表型[15]。研究表明，pka信號通路的激活可以提高runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的穩(wěn)定性和活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[16]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)通過依賴PKA機(jī)制來抑制鹽誘導(dǎo)激酶1(salt-inducible kinase 1，SIK1)的表達(dá)和SIK1活性，從而刺激成骨作用[17]。但是對斑馬魚骨骼形成的研究中主要集中在單通路的調(diào)控機(jī)制方面，其兩個甚至多個通路之間的調(diào)控作用的研究卻處于初級階段。所以本研究克隆了斑馬魚N1aICD胞內(nèi)段和pka啟動子，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)更直觀地證明了N1aICD胞內(nèi)段對pka基因的轉(zhuǎn)錄抑制效率達(dá)到69.44 %。

我們的研究結(jié)果表明斑馬魚notch1a分子過表達(dá)負(fù)向調(diào)控pka的表達(dá)。而pka參與的MAPK信號通路與Notch通路相互作用，共同調(diào)控斑馬魚成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的分化，為魚類骨骼發(fā)育機(jī)制的研究提供嶄新的認(rèn)識，對人類骨骼疾病的分子機(jī)制提供一定的借鑒意義，但詳細(xì)機(jī)制有待今后深入研究。