陳華梅 黃楓 申震 林海雄 黃敏玲 李紫閣 李定 吳真 姜自偉

1. 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加，骨折風險增加為特征的全身系統(tǒng)性骨病[1]。隨著年齡的增長，該病患病率越高[2]，已成為一種慢性多發(fā)常見病[3]，我國OP的總患病率為13 %[4]，2010年至2016年60歲以上人群OP總體患病率約為36 %[5]；對于OP的防治，西藥大體有促進骨礦化藥、抑制骨吸收藥以及促進骨形成藥[6]，但價格昂貴及不良反應(yīng)[7-8]，部分人難以接受，而“簡、便、廉、驗”的中醫(yī)治療不失為一種選擇。

當歸補血湯首創(chuàng)于金代醫(yī)家李東垣，由黃芪、當歸組成，兩藥[10]皆為治療OP常用藥；研究[9]表明當歸補血湯能改善小鼠紅細胞功能，改善小鼠的骨髓抑制并且增強機體免疫功能[11]；此外還能保護心腦血管功能[12]、抗氧化[13]、抑制腫瘤細胞增殖[14]、改善骨小梁結(jié)構(gòu)[15]、正向調(diào)節(jié)成骨細胞分化[16]。目前國內(nèi)不乏對于當歸補血湯有效成分的研究[17]，但機理仍未探清，基于此，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學角度對當歸補血湯治療OP的分子機制進行探究，為臨床提供導向。

1 材料和方法

1.1 當歸補血湯有效成分、對應(yīng)靶點及靶基因的獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取當歸補血湯所有化學成分，根據(jù)OB>30 %、DL>0.18以及HL>4條件篩選出有效成分及對應(yīng)靶點；通過Uniport數(shù)據(jù)庫及NCBI數(shù)據(jù)庫，限定物種為“人”，篩選出對應(yīng)的靶基因。

1.2 OP對應(yīng)靶基因獲取

借助GeneCards(https://genealacart.genecards.org)數(shù)據(jù)庫，以“Osteoporosis”為檢索詞，限定物種為“人”，檢索OP的相關(guān)靶基因。

1.3 “有效化學成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將獲取的有效化學成分對應(yīng)靶基因與獲取的OP相關(guān)靶基因通過生物信息學與進化基因組學網(wǎng)站繪制Venn圖，整理有效化學成分-疾病靶點資料，運用Cytoscape 3.5.1軟件中的“Network Analyzer”功能對資料進行分析，節(jié)點(node)有疾病、有效成分、有效成分-疾病共同靶基因，邊(edge)代表組分之間聯(lián)系, 并篩選出當歸補血湯作用于OP的關(guān)鍵化合物。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的篩選

將取得的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中，限定物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評分設(shè)置為“highest confidence(0.90)”，隱藏獨立與其他蛋白無連接的蛋白，余參數(shù)保持默認設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖，再借助R軟件統(tǒng)計分析得到所有蛋白鄰接節(jié)點數(shù)目，統(tǒng)計分析排名前30的靶蛋白。

GO功能分析與KEGG通路富集分析借助R軟件將取得的交集基因轉(zhuǎn)化基因ID，進行基因功能、通路富集分析，設(shè)置條件P<0.05，限制物種為“人”，P值越小，富集越顯著，排名越前，統(tǒng)計分析排名前20的基因功能與通路。

2 結(jié)果

2.1 有效成分、靶基因

篩選出有效化合物黃芪共15個(除去1個無靶點的化合物)，當歸2個，總計17個，如下表1示；有效化合物對應(yīng)靶基因共184個(重復基因只留1個)。

2.2 疾病靶基因

獲取OP相關(guān)靶基因3 368個。

2.3 藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

將步驟1.1中184個靶基因與步驟1.2中獲取的3 368個靶基因取交集，如圖1，得出130個交集基因。利用Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建有效成分-疾病-靶點互作網(wǎng)絡(luò)，如圖2，共148個節(jié)點(node)，其中外圈綠色圓形為130個靶基因，內(nèi)圈中三角形為17個有效化合物(其中紫色為黃芪的15個有效化合物；黃色為當歸2個有效化合物)，兩圈之間紅色菱形為疾病，共423條邊(edge)；根據(jù)MCC算法得出前7個關(guān)鍵化合物，其中當歸2個，黃芪5個，如表2。

表1 當歸補血湯候選化合物成分Table 1 Candidate compounds in DGBXD

圖1 藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)Venn圖Fig.1 Venn diagram of drug-disease network

圖2 中藥有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of active component-disease-target of traditional Chinese medicine

表 2 當歸補血湯治療OP核心活性成分

2.4 PPI互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及靶蛋白篩選

將130交集靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，獲得117個靶蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，如圖3(其中13個靶蛋白未發(fā)生相互作用)，共880條邊，通過R軟件統(tǒng)計分析出的排名前30的靶蛋白，如圖4，其中靶蛋白主要有JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK14、ESR1、MAPK8、FOS、CXCL8、VEGFA。

圖3 當歸補血湯治療OP靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 OP target proteins PPI network treated with DGBXD

圖4 排名前30的靶蛋白Fig.4 Top 30 target proteins

2.5 GO功能分析

通過R軟件進行基因功能分析得出，130個交集基因涉及138個生物過程，P值越小，排名越前，統(tǒng)計分析前20生物功能如表3、圖5、圖6，主要涉及核受體活性、 配體轉(zhuǎn)錄因子活性、 調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性等功能，涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞凋亡、炎性反應(yīng)、白細胞粘附聚集生物過程。

圖5 GO功能富集分析Fig.5 Analysis of GO function enrichment

圖6 GO功能分析氣泡圖Fig.6 Bubble chart of GO function analysis

2.6 KEGG通路富集分析

共富集在149條生物信息通路(P<0.05)，排名前20通路如圖7、圖8，主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、乙型肝炎、前列腺癌、TNF信號通路等通路。

圖7 KEGG富集通路分析Fig.7 Analysis of KEGG pathway enrichment

圖8 KEGG通路氣泡圖Fig.8 Bubble chart of KEGG pathways

3 討論

OP的發(fā)生被認為與活性氧(ROS)誘導的體內(nèi)氧化應(yīng)激極其密切[18]，不限于主流的觀點由缺乏雌激素引起[19]；研究[20]表明增齡與氧化應(yīng)激反應(yīng)正相關(guān)，與抗氧化能力負相關(guān)，提示氧化應(yīng)激與增齡性骨量減少關(guān)系密切；絕經(jīng)后雌激素的缺乏，導致成骨細胞活性氧增加，抗氧化酶水平降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)活躍，進而加快OP進程[21]，而激素療法[22]作為防治OP方法，并不能明顯改善OP癥狀。ROS作為氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子，生理情況下，氧化-抗氧化處于動態(tài)平衡狀態(tài)[19]；當機體處于氧化應(yīng)激條件時，ROS可以通過聯(lián)級反應(yīng)抑制成骨細胞分化，誘導成骨細胞凋亡，降低成骨細胞功能[23]，使成骨效應(yīng)滯后于破骨，進而引發(fā)OP。

從上述所獲7個關(guān)鍵成分中，槲皮素具有強抗氧化作用[24,27]，能提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性，此外還可發(fā)揮抗炎作用[24]；毛蕊異黃酮、芒柄花素可直接清除氧自由基[25]；山奈酚[26]能增加超氧化物歧化酶活性，消除氧自由基，降低ROS含量，從而減輕氧化應(yīng)激造成的細胞凋亡；異鼠李素同樣具有強氧自由基清除能力[27]；豆甾醇與β-谷甾醇有天然的氧自由基清除能力，能抑制PGE2表達發(fā)揮抗炎能力；β-谷甾醇還可發(fā)揮雌激素樣作用[28], 而雌激素能夠刺激成骨細胞且抑制破骨細胞的作用；研究[30-31]證明山奈酚有明顯的雌激素作用，可以顯著激活成骨細胞表面雌激素受體ER的活性，促進成骨，改善骨質(zhì)疏松狀態(tài)。雌激素缺乏、氧化應(yīng)激條件下, ROS水平上升，可將Wnt/β-catenin信號通路中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄達到消除ROS目的, 最終導致成骨減弱同時使成骨細胞OPG和RANKL表達失衡[32]，引起RANKL與特異性受體RANK結(jié)合, 激活JNK通路、ERK通路、Akt通路與作為下游的NF-κB通路[33]，誘導破骨細胞重要的轉(zhuǎn)錄因子如原癌基因c-fos等的表達, 促進破骨，阻止破骨細胞凋亡[32]，而槲皮素[27]、山奈酚[26]、異鼠李素[27]等降低ROS水平或起雌激素樣作用，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)骨代謝。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細胞介導胞內(nèi)外刺激傳導的信號通路，MAPK家族有三大成員，分別為ERK、JNK及p38 MAPK信號通路，其介導的自噬在調(diào)控破骨細胞分化中具有重要作用。喻琴云等[29]通過研究發(fā)現(xiàn)芒柄花素可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9表達, 可誘導P38MAPK發(fā)生磷酸化，并且認為后者經(jīng)過信號級聯(lián)放大的反應(yīng)過程活化凋亡的途徑, 導致破骨細胞發(fā)生凋亡，考慮與P38MAPK/ MMP-9信號通路有關(guān)。異鼠李素[34]能顯著減輕過氧化物誘導的細胞DNA損傷和凋亡，經(jīng)過各級反應(yīng)進而參與ERK通路的激活，增強細胞抗氧化防御能力，揭示了異鼠李素誘導的細胞保護作用可能來自ERK信號通路的激活。有研究[43]表明PI3K/AKT/FoxO/NF-κB通路是調(diào)節(jié)細胞凋亡與氧化平衡的另一條重要通路，槲皮素可激活此通路促進成骨改善OP狀態(tài)。槲皮素[35]能明顯抑制TNF-α誘導內(nèi)皮細胞表達ICAM-1和IL-6炎性蛋白，進而抑制炎癥因子刺激破骨細胞的分化。而JUN家族蛋白中c-jun蛋白作為JNK通路的下游信號，在骨代謝非經(jīng)典通路中，JNK通路可被激活，募集c-jun激活NF-κB通路進而抑制成骨蛋白表達，介導破骨細胞分化[36]；晁杲等[37]通過實驗分析認為異鼠李素可通過抑制JNK的活化, 抑制NF-κB通路的活化, 抑制破骨細胞分化。李婧等[38]揭示異鼠李素對破骨前體細胞分化具有抑制作用的機制可能與NF-κB通路的抑制有關(guān)。Yang等[39]認為山奈酚和槲皮素可通過細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)和雌激素受體通路增加Mg-63型成骨細胞樣細胞的堿性磷酸酶(ALP)活性，并認為山奈酚是一種有效的抗破骨劑。OP往往作為糖尿病并發(fā)癥存在[40]，在AGE-RAGE信號通路中，AGEs是一種糖基化終產(chǎn)物，能結(jié)合RAGE引起氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)OP；前者還可上調(diào)RAGE的表達，通過Wnt/β-catenin 通路交叉作用抑制成骨分化[41]；劉貴波等[42]研究證實山奈酚可以抑制AGEs誘發(fā)RAGE的表達，從而可間接地抑制OP發(fā)生。

綜上，本研究顯示當歸補血湯能通過多成分、多靶點、多通路作用于OP，可能與其發(fā)揮抗氧化作用和雌激素樣作用有關(guān)，可為下一步實驗驗證提供理論基礎(chǔ)。