許坤 龐堅* 張潔帆 王用玉 趙詠芳 郭海玲

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海 200120 2.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 200120

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)是由于長期使用糖皮質(zhì)激素造成骨密度和骨量下降、骨質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致骨脆性增強、骨折風(fēng)險增加的代謝性骨病，是最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[1]。至今，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC))類藥物在臨床仍是無可替代的，雖然GC的使用會產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，包括骨量丟失和骨折[2-3]。接受GC長期治療的患者中，約10 %以上被臨床診斷發(fā)生骨折，而30 %～40 %的患者具有椎骨骨折的影像學(xué)證據(jù)[4-5]。GIOP已經(jīng)成為世界范圍的日益嚴(yán)重的健康問題。在補充鈣劑、維生素D與改變生活方式的基礎(chǔ)上，雙膦酸鹽類藥物仍是受推薦的一線藥物[6]，但隨著雙膦酸鹽治療時間的延長，骨壞死、非典型股骨骨折的發(fā)生率都見增加[7]，可能由于骨吸收抑制劑與GC同時使用，導(dǎo)致骨形成進一步減少，從而妨礙骨的重建所致。因此，目前GIOP的臨床治療仍然存在著廣泛的爭議[8]。

淫羊藿[9]又名仙靈脾，來源于毛茛目小檗科淫羊藿屬植物。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為其性溫，味辛、甘，入肝、腎經(jīng)，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效，常用于治療腎陽虛衰、筋痿骨軟、風(fēng)濕痹痛等癥。多項文獻研究[10-11]顯示，在防治骨質(zhì)疏松的中醫(yī)藥處方中，淫羊藿為其中使用頻率最高的藥物。而現(xiàn)代藥理學(xué)研究[12]顯示，淫羊藿組分能促進成骨細胞分化、抑制破骨細胞活性與抑制GC誘導(dǎo)的骨細胞凋亡，故而淫羊藿在GIOP防治領(lǐng)域具有廣闊研究空間與開發(fā)潛力。淫羊藿的成分復(fù)雜，進一步探索淫羊藿治療GIOP的具體藥物分子機制實屬必要。

本研究基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)、GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、R軟件(v4.0.0)、perl軟件(v5.28.1)、UniProt數(shù)據(jù)庫、Cytoscape軟件(v3.7.0)、String在線軟件(v11.0)等研究工具，從分子水平探討淫羊藿治療GIOP的潛在藥物成分及機制，為后續(xù)藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 篩選淫羊藿的活性成分

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP：http://http://tcmspw.com/tcmsp.php)是世界上最大的非商業(yè)中藥分子數(shù)據(jù)庫之一，收集了《中國藥典》中收錄的499味中草藥，包括3 311個靶點和29 384種成分[13]，形成了一個統(tǒng)一完整的中藥藥效學(xué)預(yù)測與驗證體系?？诜锢枚?OB)是口服藥物重要的藥代動力學(xué)性質(zhì)之一，它對藥物進入體循環(huán)的效率起著重要的作用。類藥性(DL)是一個定性概念，旨在幫助優(yōu)化藥物動力學(xué)和藥物特性。本研究確定淫羊藿的活性成分篩選標(biāo)準(zhǔn)為OB>30 %，DL>0.18。

1.2 將淫羊藿活性成分進行靶點預(yù)測，并對靶點添加基因名

利用TCMSP開發(fā)的靶點預(yù)測模型，進一步預(yù)測了淫羊藿活性成分的相關(guān)靶點，再通過perl軟件和UniProt (http://www.uniprot.org/) 數(shù)據(jù)庫對預(yù)測出的靶點進行添加基因名。

1.3 獲取GIOP的靶點基因

GeneCards[14]數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)是一個將人類基因、編碼的蛋白質(zhì)的功能以及所涉及的疾病整合為一體的數(shù)據(jù)庫。Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)數(shù)據(jù)庫[15](https://omim.org/)是有關(guān)基因和遺傳表型及其之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫。將“glucocorticoid induced osteoporosis”作為關(guān)鍵詞，通過GeneCards和OMIM兩個數(shù)據(jù)庫同時搜索GIOP的靶點基因，去除兩個數(shù)據(jù)庫中的重復(fù)結(jié)果，獲得GIOP疾病靶點基因。最后利用R軟件將淫羊藿靶點基因與GIOP靶點基因進行交集分析，并繪制出韋恩圖。

1.4 構(gòu)建“淫羊藿-GIOP”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

運用perl軟件將淫羊藿靶點基因與“淫羊藿-GIOP”共同靶點基因一一映射，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化處理，得到“淫羊藿-GIOP”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建淫羊藿治療GIOP的靶點基因蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將“淫羊藿-GIOP”共同靶點基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入String在線軟件(https://string-db.org/)，選擇種屬為“Homo sapiens”，設(shè)置最小互作得分為0.4，構(gòu)建出PPI網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)出相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.6 篩選PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點基因

將1.5導(dǎo)出的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)利用R軟件進行計算，得到PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因條圖。

1.7 GO和KEGG功能富集分析

為進一步闡述淫羊藿對GIOP的作用機制，將“淫羊藿-GIOP”共同靶點基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入R軟件，進行GO功能富集分析和KEGG功能富集分析，并繪制出相關(guān)柱狀圖及氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿活性成分的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫一共檢索到淫羊藿130個活性成分，再根據(jù)制定的篩選標(biāo)準(zhǔn)(OB>30 %，DL>0.18)進行篩選，得到淫羊藿23個主要活性成分，見表1。

表1 淫羊藿主要活性成分表Table 1 Main active components of herba epimedii

2.2 淫羊藿活性成分靶點預(yù)測

將篩選出的淫羊藿活性成分進行靶點預(yù)測后，再通過perl軟件和UniProt數(shù)據(jù)庫對預(yù)測出的靶點添加基因名，去除UniProt數(shù)據(jù)庫中檢索不到的靶點和重復(fù)靶點，最終獲得106個淫羊藿活性成分靶點。

2.3 獲取GIOP靶點基因與淫羊藿活性成分靶點取交集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索，獲得1 519個GIOP相關(guān)靶點基因，通過OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，得到185條GIOP疾病相關(guān)靶點，將兩個數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果合并后剔除重復(fù)靶點，最終獲得1 801個GIOP疾病靶點基因。再將其與淫羊藿活性成分靶點取交集，結(jié)果顯示(圖 1)“淫羊藿-GIOP”交集靶基因共有65個。

圖1 “淫羊藿-GIOP”交集靶基因Fig.1 Regulatory network diagram of herba epimedii-GIOP

2.4 “淫羊藿-GIOP”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Cytoscape軟件將數(shù)據(jù)進行可視化處理，得到“淫羊藿-GIOP”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(圖 2)。圖中菱形表示GIOP，六邊形表示中藥淫羊藿，三角形表示淫羊藿的活性成分，橢圓形表示GIOP和淫羊藿的共同靶點基因。圖中顯示，淫羊藿主要通過20個活性成分作用于65個靶點基因來調(diào)控GIOP的疾病的發(fā)生。

圖2 “淫羊藿-GIOP”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Regulatory network diagram of herba epimedii-GIOP

2.5 淫羊藿治療GIOP的靶點基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用String在線軟件構(gòu)建出“淫羊藿-GIOP”共同靶點基因的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖 3)，圖中顯示一共有64個節(jié)點，622條相互關(guān)系。通過各節(jié)點之間的相互關(guān)系，篩選出連接次數(shù)較多的5個靶點基因作為核心靶點基因(圖 4)，分別為白細胞介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原激活蛋白激酶-8(MAPK8)、胱冬酶-3(CASP3)、雌激素受體-1(ESR1)。

圖3 “淫羊藿-GIOP”共同靶點基因PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of common target gene of herba epimedii-GIOP

圖4 核心靶點基因Fig.4 Core target genes

2.6 GO功能富集分析

將淫羊藿治療GIOP的核心靶點基因進行GO功能富集分析后得到如下柱狀圖(圖5)和氣泡圖(圖6)。圖中顯示，淫羊藿治療GIOP的核心靶點基因的GO功能主要包括核受體活性(nuclear receptor activity)、轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄劑活性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase II-specific)、類固醇結(jié)合(steroid binding)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase II transcription factor binding)、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性與細胞凋亡的關(guān)系(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process)、核激素受體結(jié)合(nuclear hormone receptor binding)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、激素受體結(jié)合(hormone receptor binding)、泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(activating transcription factor binding)、雌激素受體結(jié)合(estrogen receptor binding)、類固醇激素受體結(jié)合(steroid hormone receptor binding)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)、RNA聚合酶II基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase II basal transcription factor binding)等。由此可以推測出淫羊藿的活性成分主要通過調(diào)節(jié)以上生物功能來發(fā)揮其治療GIOP的功效。

圖5 GO柱狀圖Fig.5 GO bar plot

圖6 GO氣泡圖Fig.6 GO dot plot

柱狀圖和氣泡圖左側(cè)為GO名稱；柱狀圖下面的數(shù)字表示富集基因數(shù)目，氣泡圖下面的數(shù)字表示基因比例；氣泡圖中氣泡大小表示富集基因數(shù)目，氣泡越大，富集基因越多；柱狀圖和氣泡圖中的圖形均按P值著色，P值越小，顏色越紅，富集程度越高。

2.7 KEGG通路富集分析

將淫羊藿治療GIOP的核心靶點基因進行KEGG功能富集分析后得到如下柱狀圖(圖 7)和氣泡圖(圖 8)。圖中顯示，淫羊藿治療GIOP的核心靶點基因的KEGG通路主要有前列腺癌信號通路(prostate cancer)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、細胞凋亡信號通路(apoptosis)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙肝病毒信號通路(hepatitis B)、麻疹信號通路(measles)、結(jié)直腸癌信號通路(colorectal cancer)、人巨細胞病毒感染信號通路(human cytomegalovirus infection)、甲狀腺素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)等。由此可以推測出淫羊藿的活性成分有可能通過調(diào)節(jié)這些信號通路來發(fā)揮其治療GIOP的功效。

圖7 KEGG柱狀圖Fig.7 KEGG bar plot

圖8 KEGG氣泡圖Fig.8 KEGG dot plot

柱狀圖和氣泡圖左側(cè)為KEGG名稱；柱狀圖下面的數(shù)字表示富集基因數(shù)目，氣泡圖下面的數(shù)字表示基因比例；氣泡圖中氣泡大小表示富集基因數(shù)目，氣泡越大，富集基因越多；柱狀圖和氣泡圖中的圖形均按P值著色，P值越小，顏色越紅，富集程度越高。

3 討論

基于“疾病-基因-靶點-藥物”作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)整合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科研究藥物活性成分作用機制的新方法，通過系統(tǒng)分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響，從活性成分、蛋白靶點等分子水平揭示藥物潛在作用機理，使得快速高效地探索中藥的多成分、多靶點、多途徑的作用機制成為可能。既往已有學(xué)者進行過淫羊藿治療骨質(zhì)疏松癥[16]、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[17]、激素性股骨頭壞死[18]的相關(guān)機制研究。而淫羊藿在GIOP的臨床治療中運用廣且療效佳，但對其相關(guān)機制研究的報道甚少，故筆者將其作為研究方向。

研究結(jié)果提示，淫羊藿可能通過多成分、多靶點、多通路影響GIOP的發(fā)病。淫羊藿治療GIOP的5個核心基因分別為白細胞介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原激活蛋白激酶-8(MAPK8)、胱冬酶-3(CASP3)、雌激素受體-1(ESR1)。文娛等[19]在一項骨質(zhì)疏松小鼠模型的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以通過下調(diào)骨組織中IL-6的陽性表達，從而抑制骨質(zhì)吸收，達到抗骨質(zhì)疏松的作用。VEGFA是VEGF家族中的一種，VEGF可以通過增強成骨細胞中的堿性磷酸酶活性[20]，從而促進成骨細胞的增殖與分化，改善骨質(zhì)。游利[21]通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)，干預(yù)CASP3的表達可以增強堿性磷酸酶活性，誘導(dǎo)成骨相關(guān)基因的表達。雌激素在骨代謝的過程中發(fā)揮著重要作用[22]，研究[23]表明，骨細胞中的ERα可通過調(diào)節(jié)骨小梁的形成抑制骨質(zhì)疏松。

研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿治療GIOP的相關(guān)分子機制主要集中在與細胞增殖分化、免疫和內(nèi)分泌相關(guān)的3類途徑中，主要包括前列腺癌信號通路、細胞凋亡信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、TNF信號通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路、乙肝病毒信號通路和麻疹信號通路等，提示淫羊藿可能通過這些信號通路來影響GIOP的發(fā)展。①前列腺癌信號通路：有研究者[24]對日本長期接受雄激素剝奪治療的前列腺癌患者進行調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示接受雄激素剝奪治療6年后的前列腺癌患者，骨質(zhì)疏松癥患病率達到45 %，而且隨著接受雄激素剝奪治療時間的延長，前列腺癌患者的骨質(zhì)疏松患病率有統(tǒng)計學(xué)意義的增加，可見骨密度變化與前列腺癌及其治療方式有關(guān)。②細胞凋亡信號通路：細胞凋亡信號與GIOP的發(fā)病關(guān)系密切，Sato等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)，GC通過誘導(dǎo)Pyk2磷酸化，促進成骨細胞和骨細胞凋亡，延長破骨細胞的壽命，導(dǎo)致骨吸收增加，從而引起GIOP的發(fā)病。③流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路：有研究[26]發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化疾病的發(fā)病過程中，骨保護素通過參與調(diào)控血管因子發(fā)揮作用，而骨保護素同時也是參與骨代謝的重要蛋白，因此筆者推測骨保護素通過參與調(diào)控動脈粥樣硬化信號通路從而影響了GIOP的發(fā)病。④TNF信號通路：TNF-α因子可以通過加快骨質(zhì)吸收、抑制骨質(zhì)再生，在調(diào)節(jié)骨代謝的過程中發(fā)揮著重要作用[27]。⑤糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路：王寓平[28]通過實驗發(fā)現(xiàn)，AGEs/RAGE對內(nèi)皮祖細胞轉(zhuǎn)化為成骨細胞具有積極作用，由此可以推測AGEs/RAGE信號通路與骨質(zhì)疏松疾病的發(fā)展存在關(guān)系。⑥乙肝病毒信號通路：王三杏等[29]通過對1 033例體檢數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者的乙肝感染率明顯高于骨質(zhì)正常者，提示骨質(zhì)疏松與乙肝病毒可能存在一定關(guān)系。⑦麻疹信號通路：麻疹與GIOP發(fā)病機制的相關(guān)研究報道較少，有待進一步研究。

綜上所述，淫羊藿有可能是通過前列腺癌信號通路、細胞凋亡信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、TNF信號通路和糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路等多個途徑作用于白細胞介素-6、血管內(nèi)皮生長因子A、絲裂原激活蛋白激酶-8、胱冬酶-3和雌激素受體-1等靶點參與調(diào)節(jié)骨形成和破骨吸收之間的平衡，從而達到防治GIOP的作用。此次基于多個數(shù)據(jù)庫運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對淫羊藿治療GIOP的分子機制研究，為后期的藥效機制研究提供了新的思路和方向。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法所涉及的數(shù)據(jù)庫及軟件算法等多方面有著一定的局限性，因此為取得更加可靠的研究結(jié)果，還需進一步通過實驗驗證。