陳 璞

（東莞市第八人民醫(yī)院，廣東 東莞523000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種與遺傳、環(huán)境等因素密切相關(guān)的慢性全身性炎癥性疾病，全球發(fā)病率為0.5%～1.0%［1］，主要發(fā)病人群為中老年人，且女性發(fā)病率高于男性［2］?，F(xiàn)代基因測(cè)序技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)幾萬個(gè)基因的表達(dá)值，可用于研究RA的發(fā)病機(jī)制，對(duì)RA滑膜組織采用新的測(cè)序技術(shù)來進(jìn)行表達(dá)譜分析。YOSHIDA等［3］發(fā)現(xiàn)與骨關(guān)節(jié)炎患者相比，RA患者滑膜中與炎癥相關(guān)的STAT1、IRF1、CXCL9、CXCL10和CCL5基因表達(dá)量明顯升高。YAMAGUCHI等［4］發(fā)現(xiàn)RA女性患病率高于男性，提示女性性激素可能參與該病的發(fā)病機(jī)制。DEL等［5］研究表明低氧誘導(dǎo)了健康滑膜成纖維細(xì)胞（HSF）和RA滑膜成纖維細(xì)胞（RASF）基因表達(dá)的顯著變化，并證實(shí)了RASF和HSF之間的差異。目前，雖然有大量研究工作正在探索RA的發(fā)生機(jī)制［6-9］，但是其發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確。RA發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)RA的早期診斷及有效治療具有重要意義。

本研究的RA相關(guān)數(shù)據(jù)來自美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫共享的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。本文利用R語言limma包對(duì)GSE55235［10］表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理、差異表達(dá)分析等，得到與RA相關(guān)的差異表達(dá)基因，然后對(duì)表達(dá)差異的基因做基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，最后通過STRING數(shù)據(jù)（http：//www.string-db.org/）構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，篩選網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中與RA發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)基因節(jié)點(diǎn)的接近度越大，表明越重要。本研究的主要目的是篩選與RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)的重要基因，并探索RA的潛在分子發(fā)病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫芯片數(shù)據(jù)的獲取 基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是NCBI網(wǎng)站到目前為止最全面的公開基因測(cè)序數(shù)據(jù)集［11］。從NCBI下 載 基 于Affymetrix human genome U133A芯片的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE55235，平臺(tái)為Affymetrix GPL96，其中包含來自正常膝關(guān)節(jié)的10個(gè)正?；そM織樣本以及10個(gè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜組織樣本。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選RA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)利用R語言的affy包［12］進(jìn)行預(yù)處理和limma包［13］進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出表達(dá)差異基因。其中篩選條件為P＜0.01且logFC＞1，對(duì)得到的差異基因進(jìn)行火山圖顯示和熱圖的分類效果圖分析。

1.3 差異基因的GO和KEGG富集分析 為了解差異基因的生物學(xué)功能，采用R語言的cluster Profiler包［14］對(duì)與RA相關(guān)的差異基因進(jìn)行了GO和KEGG生物功能富集分析。其中GO富集分析分別從生物進(jìn)程（biological processes，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）等三方面進(jìn)行。KEGG富集分析針對(duì)差異基因富集的通路，通過超幾何檢驗(yàn)計(jì)算差異基因與通路的顯著性P值，根據(jù)通路中的基因數(shù)據(jù)＞10且P＜0.01條件得到與RA發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路。

1.4 PPI網(wǎng) 絡(luò) 構(gòu) 建STRING數(shù) 據(jù)（http：//www.string-db.org/）是蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫［15］。其中包含蛋白質(zhì)之間的直接相互作用和間接相互作用。本研究通過R語言STRINGdb包［16］構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎差異基因的蛋白質(zhì)交互（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 差異基因分析 通過affy開始進(jìn)行原始芯片歸一化處理，然后通過R語言limma包的差異分析，最終得到876個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因536個(gè)，下調(diào)基因340個(gè)。差異表達(dá)基因結(jié)果見火山圖（圖1），方形代表上調(diào)基因；圓形代表下調(diào)基因；三角形代表無差異基因。利用R語言中的pheatmap包繪制基因熱圖，通過差異基因?qū)φ颖九c異常樣本進(jìn)行分類，分類效果明顯，見圖2。

圖1 RA差異表達(dá)基因的火山圖

圖2 RA差異基因的熱圖分析

2.2 差異基因GO富集分析結(jié)果GO富集分析結(jié)果在生物進(jìn)程（BP）中，差異基因主要富集在白細(xì)胞遷移（Leukocyte migrate）、白細(xì)胞間的粘連（Leukocyte cell-cell adhesion）、抗原受體介導(dǎo)的信號(hào)通路（Antigen receptor-mediated signaling pathway）、細(xì)胞活化的正調(diào)節(jié)（regulation of lymphocyte activation）及T細(xì)胞激活（T cell activation）中。在細(xì)胞組成（CC）中，主要富集在質(zhì)膜的外側(cè)（External side of plasma membrane）、三級(jí)顆粒（Tertiary granule）、膜區(qū)（Membrane region）、膜筏（Membrane raft）、膜微區(qū)（Membrane microdomain）中。在分子功能（MF）中，主要富集在糖胺聚糖結(jié)合（Glycosaminoglycan binding）、MHC蛋白復(fù)合物結(jié)合（MHC protein complex binding）、細(xì)胞因子受體活性（Cytokine receptor activity）、細(xì)胞因子結(jié)合（Cytokine binding）、硫化合物結(jié)合（Heparin binding）中，見表1。

表1 顯著的GO和KEGG通路分析的結(jié)果

2.3 差異基因KEGG富集分析結(jié)果 為了得到與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)通路，通過cluster Profiler包對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要集中在Osteoclast differentiation、Leishmaniasis、B cell receptor signaling pathway、Primary immunodeficiency、Hematopoietic cell lineage、Rheumatoid arthritis、Th17 cell differentiation、Epstein-Barr virus infection、T cell receptor signaling pathway等通路中。結(jié)果見表1。

2.4 差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 筆者使用R語言STRINGdb包處理構(gòu)建了包含706點(diǎn)、1 245個(gè)邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。在PPI網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，通過每個(gè)節(jié)點(diǎn)的接近度值的大小來表示該基因在網(wǎng)絡(luò)中的重要性大小，接近度值位列前10名的基 因 分 別 為EGFR、CD8A、CCR7、RAC2、EGR1、PPARG、CDKN1A、CD4、ZAP70和JUN，預(yù)示著這些基因可能與RA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，見表2。

圖3 RA差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜增生、浸潤和軟骨降解。本文通過對(duì)RA患者樣本與正常樣本進(jìn)行基因表達(dá)譜的對(duì)比分析，篩選了876個(gè)差異表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄本，參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎趨化因子信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化和病毒性心肌病等信號(hào)通路，涉及了白細(xì)胞遷移、免疫反應(yīng)激活細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、細(xì)胞活化的正調(diào)節(jié)、T細(xì)胞激活等生物學(xué)過程。筆者進(jìn)一步通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到關(guān)鍵基因，包括EGFR、CD8A、CCR7、RAC2、EGR1、PPARG、CDKN1A、CD4、ZAP70和JUN。

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)中前10名差異基因的接近度情況

EGFR（epidermal growth factor receptor）是上皮生長因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體。HUANG等［17］研 究 表 明RA與EGFR基 因 中 的rs17337023 SNP有關(guān)，并且血清EGFR蛋白水平升高。這些發(fā)現(xiàn)表明EGFR作為RA的治療靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)16個(gè)基因的簽名可以有效區(qū)分RA與骨性關(guān)節(jié)性（OA），其中包括CD8A基因，提出以CD8A為特征的分類方法可以改善RA患者的診斷和治療［18］。另有研究表明CCL21/CCR7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在RA發(fā)病機(jī)理具有不同階段的功能意義，CCR7是RAM1滑液（SF）巨噬細(xì)胞的標(biāo)志，它在RA單核細(xì)胞和體外分化的巨噬細(xì)胞中的表達(dá)與疾病活動(dòng)評(píng)分（DAS28）密切相關(guān)［19］。趨化因子受體CCR7及其配體CCL19和CCL21指導(dǎo)樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞在淋巴器官中的歸巢和定位，從而有助于適應(yīng)性免疫和免疫耐受的多個(gè)方面。文獻(xiàn)［20］調(diào)查了CCR7在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）發(fā)病機(jī)理中的作用。通過使用新型抗人CCR7抗體和人源化CCR7小鼠，評(píng)估了CCR7作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）自身免疫模型的靶標(biāo)。DEY等［21］發(fā)現(xiàn)RA滑膜和巨噬細(xì)胞中iNOS相互作用蛋白ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物2（RAC2）的一致上調(diào)。重要的是，他們已經(jīng)構(gòu)建了一個(gè)模型來解釋IFN和IL-10途徑對(duì)Rac2-iNOS相互作用的影響，該相互作用導(dǎo)致NO的過量產(chǎn)生，從而引起RA滑膜的慢性炎癥。因此，STAT1和RAC2在NO調(diào)節(jié)中的相互作用可能對(duì)RA的治療靶標(biāo)的確定有影響。差異甲基化基因（DMG）可能參與神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑、癌癥途徑、ECM-受體相互作用和RA中的粘著通路。此外，CTCF、c-MYC、YY1和EGR1可通過調(diào)節(jié)差異甲基化基因（DMG）在RA中發(fā)揮重要作用［22］。JALIL等［23］研究表明，PPARG基因的編碼變體Pro12Ala（rs1801282）與巴基斯坦人的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)。還有些研究結(jié)果表明，miR-146a抑制可以增強(qiáng)CDKN1A的過度表達(dá)，抑制HFLS-RA的侵襲增殖［24］。針 對(duì)EGFR、CD8A、CCR7、RAC2、EGR1、PPARG、CDKN1A、CD4、ZAP70和JUN基因的檢測(cè)與靶向治療將有助于RA的早期診斷與治療。

綜上所述，本研究通過生物信息分析方法篩選出RA的表達(dá)差異基因，進(jìn)行富集分析及PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得出與RA發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因，有助于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷和治療，為尋找與RA發(fā)生發(fā)展及治療相關(guān)靶點(diǎn)的研究提供有價(jià)值的依據(jù)。