王 婧，馬 曉，尚 昆，林海珊，曹邦偉

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科，北京 100050)

胰腺癌是惡性度較高的惡性腫瘤之一，2018年全球范圍內(nèi)報告了458 918例胰腺癌新病例，預(yù)計至2040年將出現(xiàn)355 317例新病例[1]。盡管在胰腺癌的檢測和治療方面取得了進展，但患者5年生存率仍然只有9%。甲磺酸阿帕替尼是我國獨立研發(fā)的抑制腫瘤新生血管形成的靶向治療藥物，其不僅具有抑制腫瘤新生血管形成的作用，還有抑制腫瘤細胞增殖的作用[2]。本研究擬通過觀察大黃素、甲磺酸阿帕替尼以及上述2種藥物聯(lián)合應(yīng)用對胰腺癌細胞增殖能力的影響，探討其作用機制。

1 材料

1.1 細胞株

胰腺癌PANC-1細胞株購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，當細胞處于對數(shù)生長期時開始進行實驗。

1.2 藥物與試劑

實驗所用大黃素購于美國Sigma公司；甲磺酸阿帕替尼購自江蘇恒瑞公司；胎牛血清購自ExCell公司；1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司。

1.3 儀器

XD-101型CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；IX51型生物倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；80-2型臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；WH-2型振蕩器(上海滬西分析儀器廠)；UV-2450型紫外光度儀(日本SHIMADZU公司)；ELx800型酶標儀(美國BioTek公司)。

2 方法

2.1 分組

本研究共分為對照組、甲磺酸阿帕替尼組、大黃素組及聯(lián)合用藥組(大黃素+甲磺酸阿帕替尼)。實驗藥物按照特定濃度分別溶于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，對照組為不含藥物的培養(yǎng)基。

2.2 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測細胞活力

將胰腺癌PANC-1細胞鋪于96孔板內(nèi)，每孔注入細胞懸液50 μl(約含1×104個細胞)，加入1640培養(yǎng)液50 μl。待細胞充分貼壁后進行分組實驗。作用72 h后，每孔加入MTT 20 μl，37 ℃孵育4 h后吸出上清液，每孔加入二甲基亞砜 150 μl震蕩約10 min，測量波長為490 nm處的吸光度(OD)，計算細胞增殖率[3]。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法測定白細胞介素6(IL-6)、血管緊張素(1-7)[Ang(1-7)]的表達

分別收集四組細胞的上清液進行檢測，選取美國Rapid Bio公司ELISA試劑盒，按照試劑盒使用說明書檢測IL-6、Ang(1-7)水平[4]。

2.4 Western blot法檢測胰腺癌細胞內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)、Mas受體蛋白表達水平

將細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后，按照不同干預(yù)組給藥處理，置于37 ℃溫箱孵育24 h。按照經(jīng)典Western blot檢測方法，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，每樣品上樣30 g，進行蛋白電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后順序加ACE2、Mas、GAPDH一抗(1∶1 000)及二抗(1∶5 000)，到達反應(yīng)時間后，檢測雜交信號，計算蛋白含量[5]。

2.5 免疫熒光細胞化學法測定ACE2、Mas受體蛋白表達情況

將胰腺癌細胞接種至6孔板中，待其生長融合度達85%時，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后進行免疫熒光細胞化學染色，觀察ACE2、Mas受體蛋白表達情況，用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝取熒光圖像[5]。

2.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，正態(tài)分布者通過兩獨立樣本t檢驗，偏態(tài)分布者采用秩和檢驗；各測定值結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃素、甲磺酸阿帕替尼以及聯(lián)合用藥對PANC-1細胞增殖能力的影響

分別用不同濃度的大黃素(12.5、25、50、100及200 μmol/L)對PANC-1細胞進行處理，檢測結(jié)果顯示，大黃素及甲磺酸阿帕替尼單藥刺激PANC-1細胞，其抑制增殖能力均呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖1。根據(jù)半數(shù)抑制濃度(IC50)，選擇大黃素實驗濃度為100 μmol/L，甲磺酸阿帕替尼實驗濃度為40 μmol/L。加藥干預(yù)細胞后，大黃素組細胞抑制率為11.72%，甲磺酸阿帕替尼組的抑制率為15.94%，聯(lián)合用藥組的抑制率為28.84%，聯(lián)合用藥組顯著高于單藥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

A.大黃素；B.甲磺酸阿帕替尼A.emodin；B.apatinib mesylate圖1 不同濃度大黃素、甲磺酸阿帕替尼對PANC-1細胞的增殖抑制作用Fig 1 Inhibition proliferation effect of emodin combined with apatinib mesylate on PANC-1 cell at different concentrations

圖2 不同藥物干預(yù)對PANC-1細胞的增殖抑制作用Fig 2 Inhibition proliferation effect of different drug interventions on PANC-1 cell

3.2 大黃素、甲磺酸阿帕替尼以及聯(lián)合用藥組細胞上清液中IL-6、Ang(1-7)水平的差異

取各組細胞上清液進行檢測IL-6、Ang(1-7)水平，對照組、大黃素組、甲磺酸阿帕替尼組及聯(lián)合用藥組的IL-6水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，甲磺酸阿帕替尼組顯著低于大黃素組，聯(lián)合用藥組顯著低于大黃素組及甲磺酸阿帕替尼組；與IL-6相反，大黃素組、甲磺酸阿帕替尼組及聯(lián)合用藥組的Ang(1-7)水平高于對照組，其中聯(lián)合用藥組最高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 四組PANC-1細胞上清液中IL-6、Ang(1-7)水平比較Tab 1 Comparison of levels of IL-6, Ang(1-7) in the cell supernatant of PANC-1 cell among four groups

3.3 Western blot方法檢測ACE2、Mas受體蛋白水平

用大黃素、甲磺酸阿帕替尼等藥物干預(yù)PANC-1細胞后提取細胞蛋白，測定不同組別ACE2、Mas受體蛋白水平。檢測結(jié)果顯示，大黃素組及甲磺酸阿帕替尼組ACE2、Mas受體蛋白表達水平高于對照組，聯(lián)合用藥組表達最高，結(jié)果見表2、圖3。

表2 四組PANC-1細胞ACE2、Mas受體蛋白水平比較Tab 2 Comparison of levels of ACE2 and Mas receptors protein in the cell supernatant of PANC-1 cell among

C.對照組；A.甲磺酸阿帕替尼組；E.大黃素組；A+E.甲磺酸阿帕替尼+大黃素組C.control group; A.apatinib mesylate group; E.emodin group; A+E.apatinib mesylate+emodin group圖3 四組細胞ACE2、Mas受體蛋白表達情況Fig 3 Expression of ACE2 and Mas receptor protein in four groups

3.4 免疫熒光檢測ACE2、Mas受體蛋白表達水平

Mas受體陽性表達呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光；ACE2表達部位在胰腺癌細胞的胞漿中；Mas表達部位在胰腺癌細胞膜。大黃素組及甲磺酸阿帕替尼單藥組ACE2及Mas受體表達高于對照組，聯(lián)合用藥組表達明顯最高，見圖4—5。

A.對照組；B.甲磺酸阿帕替尼組；C.大黃素組；D.甲磺酸阿帕替尼+大黃素組A.control group; B.apatinib mesylate group; C.emodin group; D.apatinib mesylate+emodin group圖4 四組細胞ACE2蛋白表達情況Fig 4 Expression of ACE2 protein in four groups

A.對照組；B.甲磺酸阿帕替尼組；C.大黃素組；D.甲磺酸阿帕替尼+大黃素組A.control group; B.apatinib mesylate group; C.emodin group; D.apatinib mesylate+emodin group圖5 四組Mas受體蛋白表達情況Fig 5 Expression of Mas receptor protein in four groups

4 討論

大多數(shù)胰腺癌患者就診時已是晚期，無法進行手術(shù)，目前的治療以化療為主，靶向治療尚未有大的突破[6]。諸多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠抑制腫瘤細胞的增殖[7]。其機制包括啟動線粒體誘導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡[8]；靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NCOR2和SerRS抑制血管內(nèi)皮生長因子A轉(zhuǎn)錄和腫瘤血管生成促進腫瘤細胞凋亡[9]；通過滅活PI3K/Akt信號通路在體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)耐藥[10]；可能通過激活RIP1/RIP3軸來誘導(dǎo)腫瘤細胞壞死[11]。因此，大黃素在胰腺癌的治療中起到重要作用[12]。

甲磺酸阿帕替尼片是我國自主研發(fā)的全球首個胃癌靶向藥物，其作用機制為高度選擇性競爭細胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子受體2的ATP結(jié)合位點，進而阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腫瘤新生血管生成。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲磺酸阿帕替尼本身對腫瘤細胞有一定的抑制能力[2]。已有研究結(jié)果證實，多種中藥的提取物對胰腺癌細胞可起到抑制其增殖的作用[13-14]。大黃素是傳統(tǒng)中藥大黃的主要有效成分之一，能夠抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖，具有促細胞凋亡的作用[15]。本研究觀察了大黃素、甲磺酸阿帕替尼單藥及二者聯(lián)合使用對胰腺癌細胞的抑制作用；關(guān)于各組IL-6水平的比較，甲磺酸阿帕替尼組明顯低于大黃素組，聯(lián)合用藥組明顯低于大黃素組及甲磺酸阿帕替尼組。IL-6是核因子κB信號傳導(dǎo)通路的下游炎癥介質(zhì)，通過激活轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子3，阻斷炎癥過程中的細胞凋亡，促進腫瘤細胞持續(xù)增殖。各用藥組IL-6水平的下調(diào)有助于抑制腫瘤細胞的增殖。

血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ)、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)均為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的作用底物[16]。ACE2的主要生物學作用是水解Ang Ⅱ生成Ang(1-7)[17]。Ang(1-7)通過其特異性受體(為Mas原癌基因編碼的G蛋白耦聯(lián)受體，Mas受體)，即ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸，在人體多個系統(tǒng)中發(fā)揮舒張血管、抗炎、抗凝以及保護血管內(nèi)皮等作用[5]。既往研究結(jié)果證實了ACE2在胰腺中的表達及其對胰腺的保護作用[17]。ACE2可抑制胰腺癌細胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[18]。有研究結(jié)果認為，在腫瘤組織中存在ACE2表達下調(diào)甚至缺失，且ACE2可抑制腫瘤細胞增殖，可作為一個抑癌基因發(fā)揮作用[19]。穩(wěn)定高表達ACE2基因可抑制獲得性鉑類耐藥的非小細胞肺癌細胞增殖[20]。Ye等[17]亦發(fā)現(xiàn)ACE2高水平的肝癌患者的生存期相對更長，而低水平的ACE2可作用預(yù)后差的指標之一。本研究結(jié)果顯示，大黃素和甲磺酸阿帕替尼均可提高ACE2、Mas受體水平，降低Ang(1-7)水平，實現(xiàn)通過上調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸而發(fā)揮抑制胰腺腫瘤的作用。

綜上所述，大黃素、甲磺酸阿帕替尼能夠通過上調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸，下調(diào)IL-6水平，抑制胰腺癌細胞增殖，兩藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制作用更為明顯，可起到協(xié)同效應(yīng)，從而為大黃素和甲磺酸阿帕替尼在臨床上的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。