唐紅波，馮 欣，段 微，陰赪宏，康海利，張雪艷，韓朝宏，王鶴堯,，崔 剛，張相林

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院藥事部，北京 100026； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科腫瘤科，北京100026； 3.中日友好醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100029)

妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤(gestational trophoblastic neoplasia，GTN)是由妊娠滋養(yǎng)細胞異常發(fā)育及增殖所致的與妊娠相關(guān)的腫瘤，分為低危妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤(low-risk gestational trophoblastic neoplasia，LRGTN)和高危妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤。LRGTN的一線治療藥物有甲氨蝶呤和放線菌素D[1]。甲氨蝶呤費用相對低，單藥化療方案使用廣泛，但是不良反應(yīng)較常見，部分患者甚至出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)和耐藥[2]。已有的研究結(jié)果顯示，影響藥物代謝、轉(zhuǎn)運和作用靶標的基因的多態(tài)性不僅與甲氨蝶呤的療效相關(guān)，也與其不良反應(yīng)密切相關(guān)，但不同研究間結(jié)果的差異較大，目前還無法利用血藥濃度和基因多態(tài)性精準指導(dǎo)甲氨蝶呤針對LRGTN的個體化治療[3]。為了進一步提高LRGTN 治療的有效性、安全性和經(jīng)濟性，減少甲氨蝶呤引起的不良反應(yīng)和耐藥，避免延誤病情，本課題組在前期研究[4]基礎(chǔ)上，初步探討甲氨蝶蛉血藥濃度監(jiān)測及代謝、轉(zhuǎn)運相關(guān)基因多態(tài)性檢測作為LRGTN個體化治療的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選擇2017年4—7月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診的3例LRGTN患者。第1次化療前進行國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(international federation of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO)預(yù)后評分。納入標準：血常規(guī)、肝腎功能均正常?；颊呔走x甲氨蝶呤化療方案，單次劑量為0.4 mg/(kg·d)，每日同一時間肌內(nèi)注射，連續(xù)給藥5 d為1個療程?；熎陂g監(jiān)測血常規(guī)、肝腎功能、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)水平和藥品不良反應(yīng)。不良反應(yīng)分級參照世界衛(wèi)生組織《抗癌藥物常見毒副反應(yīng)分級標準》，分為輕度、中度和重度[5]。

1.2 甲氨蝶呤血藥濃度測定

應(yīng)用EDTA-抗凝管采集患者靜脈血2 ml，以3 000 r/min離心15 min后取血漿，應(yīng)用免疫熒光法測定甲氨蝶呤濃度。

1.3 染色體核型分析

應(yīng)用EDTA-抗凝管采集患者靜脈血2 ml，分離純化獲得白細胞混懸液。應(yīng)用多重數(shù)字熒光分子雜交及雜交測序；當(dāng)寡核苷酸與染色體雜交時，其所攜帶的熒光基團會對染色體進行標記；利用熒光檢測設(shè)備，即可直接檢測雜交染色的結(jié)果，從而完成目標序列的檢測。應(yīng)用測序反應(yīng)通用試劑盒，在熒光檢測儀上完成自動化分析。檢測的基因包括：亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)C677T和A1298C以及編碼P糖蛋白的ATP結(jié)合盒B亞家族成員1轉(zhuǎn)運蛋白基因(ATP binding cassette subfamily B member 1 transporter，ABCB1)/多藥耐藥基因1(multi-drug resistance 1，MDR1)T3435C。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況

3例患者均首先應(yīng)用甲氨蝶呤進行化療，1例患者出現(xiàn)中度發(fā)熱和皮疹，1例患者出現(xiàn)發(fā)熱、Ⅲ度骨髓抑制(粒細胞群絕對值最低值為0.88)和耐藥(甲氨蝶呤化療2個療程后血HCG水平由49.2 IU/L升至93.5 IU/L)，1例患者出現(xiàn)發(fā)熱、Ⅱ度骨髓抑制(血紅蛋白為94 g/L，粒細胞群絕對值最低值為1.14)、肝功能指標升高[丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)為43 IU/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)為74 IU/L)]和耐藥(甲氨蝶呤化療3個療程，血HCG水平降低不明顯)。上述3例患者均更換化療方案繼續(xù)治療，至血HCG水平降至正常，患者未出現(xiàn)復(fù)發(fā)和明顯的不良反應(yīng)?；颊吒黜椫笜饲闆r見表1。

2.2 甲氨蝶呤的血藥濃度

3例患者第1個療程末次給藥后24 h的甲氨蝶呤血藥濃度分別為0.012、0.021和0.012 μmol/L；第3例患者于第1

表1 患者各項指標情況Tab 1 Various indicators of patients

次化療的1、3、5次給藥后2和24 h取血測甲氨蝶呤濃度，血藥濃度分別為0.953、0.016、1.132、0.012、0.934和0.012 μmol/L。

2.3 甲氨蝶呤相關(guān)基因多態(tài)性

本研究測定了甲氨蝶呤代謝相關(guān)的基因多態(tài)性MTHFR C677T、MTHFR A1298C以及與甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因ABCB1 T3435C，結(jié)果見表1。MTHFR C677T基因型方面，不良反應(yīng)較輕的1例患者為CC型；不良反應(yīng)嚴重的2例患者為CT型，其ABCB1 T3435C基因型也均為雜合突變型。3例患者的MTHFR A1298C基因型均為野生型。

3 討論

3.1 甲氨蝶呤治療LRGTN的作用機制

甲氨蝶呤是一種葉酸拮抗劑，可干擾滋養(yǎng)細胞分裂。除葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)R)外，該藥還主要通過還原型葉酸載體(reduced folate carrier，RFC)進入細胞，與細胞內(nèi)的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)結(jié)合(親和力遠遠高于細胞內(nèi)原有的二氫葉酸)，阻斷二氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生理活性的四氫葉酸(四氫葉酸為體內(nèi)合成嘌呤核苷酸和嘧啶脫氧核苷酸的重要輔酶)，從而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸合成過程中一碳單位的轉(zhuǎn)移作用受阻，導(dǎo)致DNA的生物合成明顯受到抑制，其對胸腺核苷酸合成酶亦有抑制作用[6]?；加凶甜B(yǎng)細胞腫瘤時，滋養(yǎng)細胞處于增殖活躍狀態(tài)，甲氨蝶呤對其的抑制作用更敏感，因此，臨床常用低劑量[0.4 mg/(kg·d)]甲氨蝶呤治療，即可達到很好的治療效果。參與甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運進入細胞的主要包括FR和RFC，甲氨蝶呤在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和代謝的關(guān)鍵酶主要包括葉酰多聚谷氨酸合成酶(folyl polyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS)、γ-谷氨酸水解酶(γ-glutamyl hydrolase，GGH)、DHFR和MTHFR,將甲氨蝶呤排出細胞的轉(zhuǎn)運體包括溶質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)運體家族編碼的有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽1B1(organic anion transporting polypeptide B1，OATPB1)、多藥耐藥蛋白和乳腺癌耐藥蛋白等[7-8]。雖然上述酶或轉(zhuǎn)運體的基因多態(tài)性、蛋白表達水平對甲氨蝶呤治療LRGTN時血藥濃度的影響研究可能因為各種因素而沒有統(tǒng)一確切的結(jié)論，但必須肯定的是，甲氨蝶呤藥物基因組學(xué)研究對于實施“個體化”給藥具有重大意義[7]。

甲氨蝶呤進入細胞后在FPGS的催化下轉(zhuǎn)化為更具活性、能停留在細胞內(nèi)更長時間且更具毒性的活性產(chǎn)物多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(methotrexate polyglutamate，MTXPG)；同時，GGH可作用于MTXPG，將其還原為甲氨蝶呤，維持MTXPG在體內(nèi)的動態(tài)平衡，甲氨蝶呤再經(jīng)蛋白泵泵出細胞外。甲氨蝶呤及其活性代謝物MTXPG都可與DHFR相結(jié)合，也可作用于胸苷酸合成酶，抑制其作用，導(dǎo)致DNA合成受阻[9]。甲氨蝶呤導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞分化受阻的同時，正常細胞也受到損害而發(fā)生不良反應(yīng)。亞葉酸、左亞葉酸可以給正常細胞直接補充活性葉酸，部分緩解甲氨蝶呤的不良反應(yīng)，但是不會影響甲氨蝶呤對滋養(yǎng)細胞的毒性。具體機制目前尚未研究清楚，可能是由于正常細胞轉(zhuǎn)運活性葉酸的RFC-1正常，亞葉酸進入細胞多，正常細胞內(nèi)FPGS活性低，GGH活性高，MTXPG蓄積少，亞葉酸與之結(jié)合解毒相對容易；而滋養(yǎng)細胞的細胞膜RFC-1受損，亞葉酸進入細胞少，細胞內(nèi)MTXPG蓄積多，亞葉酸解毒難度大。

3.2 基因多態(tài)性與甲氨蝶呤血藥濃度、不良反應(yīng)的相關(guān)性

本研究中，3例患者的甲氨蝶呤谷濃度均<0.1 μmol/L，肌內(nèi)注射后2 h的血藥濃度在0.934～1.132 μmol/L范圍內(nèi)，連續(xù)給藥5次后2 h的血藥濃度較第1次給藥后2 h的血藥濃度沒有明顯提高，反復(fù)給藥甲氨蝶呤在血液中未見明顯蓄積，檢測出的血藥濃度均低于中毒血藥濃度(5 μmol/L)，與文獻報道結(jié)果基本一致[10]。甲氨蝶呤血藥濃度雖然很低，但是不良反應(yīng)并不少見，有些甚至還比較嚴重，推測其原因可能與藥物轉(zhuǎn)運體及代謝基因多態(tài)性有關(guān)[2，11]。這一相關(guān)性在甲氨蝶呤大劑量(400 mg/m2，1日1次，給藥1周)靜脈滴注治療侵蝕性葡萄胎的療效觀察中得到證實[12]。宋再偉等[5]系統(tǒng)評價了骨肉瘤患者MTHFR、RFC-1和MDR1基因多態(tài)性對大劑量甲氨蝶呤不良反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，MTHFR C677T突變可能導(dǎo)致大劑量甲氨蝶呤不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險增加，MTHFR A1298C多態(tài)性與大劑量甲氨蝶呤不良反應(yīng)無顯著相關(guān)性，與本研究結(jié)果一致。而RFC1 G81A或MDR1 C3435T多態(tài)性與甲氨蝶呤不良反應(yīng)的相關(guān)性尚不明確。

目前沒有權(quán)威部門提供小劑量甲氨蝶呤血藥濃度的界定值。有研究建議，甲氨蝶呤濃度<0.05 μmol/L時可以不測定[10]。也有學(xué)者認為，甲氨蝶呤不良反應(yīng)與其血藥濃度相關(guān)，需要監(jiān)測血藥濃度并用亞葉酸鈣解救，但是證據(jù)并不充足，尚需要更多的研究提供依據(jù)。相同劑量的甲氨蝶呤對不同類型腫瘤細胞的殺傷作用可能并非完全一致，小劑量甲氨蝶呤就可以殺死處于增殖活躍狀態(tài)的滋養(yǎng)細胞，可能與妊娠滋養(yǎng)細胞合體化導(dǎo)致其敏感性增加有關(guān)[13]；雖然劑量小，但是不良反應(yīng)仍較多，部分不良反應(yīng)還很嚴重，除了與藥物轉(zhuǎn)運和代謝等基因突變有關(guān)外，是否還有其他機制，也尚待研究探討。

本研究中，不良反應(yīng)較輕患者的MTHFR C677T基因型為野生型，而不良反應(yīng)較重的2例患者的MTHFR C677T和ABCB1 T3435C基因型均為雜合突變型，MTHFR A1298C基因型為野生型。由此可見，MTHFR A1298C與甲氨蝶呤不良反應(yīng)不相關(guān)，而MTHFR C677T和ABCB1 T3435C雜合突變或者純合突變時，會發(fā)生骨髓抑制、肝功能指標升高等嚴重的不良反應(yīng)。

3.3 基因多態(tài)性與甲氨蝶呤耐藥的相關(guān)性

甲氨蝶呤耐藥仍是GTN治療的研究熱點問題[1]。因此，有必要對GTN的耐藥和復(fù)發(fā)進行討論和研究。我國2018年《妊娠滋養(yǎng)細胞疾病診斷與治療指南(第四版)》中明確提出了耐藥標準，即經(jīng)規(guī)范化療2～3個周期后，血HCG水平不降低(或降低幅度<50%)、病灶不縮小，或在治療過程中出現(xiàn)新的病灶、血HCG水平升高。約有25%的GTN患者在初始化療后發(fā)生耐藥，3%的患者會復(fù)發(fā)，上述患者需要進一步的挽救化療或聯(lián)合治療，最后會有0.5%～5%的患者因為多重耐藥而死亡[14-15]。最大腫瘤病灶5 cm、轉(zhuǎn)移病灶5個、血清β-HCG水平>105IU/ L、FIGO/世界衛(wèi)生組織預(yù)后評分5～6分可能是化療耐藥的高危因素[16-18]。陳夢捷等[14]對高預(yù)后評分的GTN患者化療效果及耐藥因素進行了分析，結(jié)果顯示，年齡>40歲、終止妊娠與初次治療的間隔時間較長是導(dǎo)致預(yù)后評分5～6分的LRGTN患者對聯(lián)合化療耐藥的高危因素。耐藥是一個多系統(tǒng)共同參與的復(fù)雜過程，涉及多基因和多條信號通路的改變。目前的研究方向主要包括細胞內(nèi)藥物的外排機制、細胞內(nèi)藥物重新分布改變、細胞凋亡抑制和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞自噬等[19]。甲氨蝶呤耐藥機制并未研究清楚，主要觀點包括：(1)RFC介導(dǎo)的甲氨蝶呤攝取障礙，而不是P糖蛋白介導(dǎo)的外排，因為P糖蛋白優(yōu)先轉(zhuǎn)運親水性有機化合物，而并非如甲氨蝶呤這種二價陰離子化合物；(2)ABCB1/MDR1基因多態(tài)性，包括C3435T、G2677T/A、C1236T、T266C、G571A、T1985G和G3751A等位點；(3)MDR編碼蛋白質(zhì)P糖蛋白表達和功能改變[20]。耐藥產(chǎn)生的根本原因在于滋養(yǎng)細胞經(jīng)甲氨蝶呤長期誘導(dǎo)后出現(xiàn)耐藥表型，導(dǎo)致影響甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運和代謝的多個基因表達的改變，可溶性CD105(內(nèi)皮聯(lián)蛋白)也可通過調(diào)控骨形態(tài)蛋白9/Smads通路參與到絨毛膜癌耐藥過程[21-22]。本研究中，發(fā)生甲氨蝶呤耐藥的2例患者未顯示出明顯的上述臨床特征，未出現(xiàn)耐藥的患者的MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因型均為野生型，而出現(xiàn)耐藥的2例患者的MTHFR C677T和ABCB1 T3435C基因型均為雜合突變型，MTHFR A1298C基因型為野生型。本研究結(jié)果初步顯示，甲氨蝶呤治療LRGTN出現(xiàn)耐藥與MTHFR C677T和ABCB1 T3435C突變有關(guān)，其他機制尚待進一步研究。

綜上所述，甲氨蝶呤不良反應(yīng)的嚴重程度、耐藥與MTHFR C677T和ABCB1 T3435C的基因型有關(guān)，與MTHFR A1298C的基因型無關(guān)；甲氨蝶呤血藥濃度與基因多態(tài)性之間未見明顯的相關(guān)性，甲氨蝶呤血藥濃度均處于低水平，患者血藥濃度之間沒有差異，不良反應(yīng)的嚴重程度、耐藥與血藥濃度未見相關(guān)性。但是，本研究只是基于3例患者甲氨蝶呤血藥濃度和基因檢測結(jié)果進行的初步探討，有待更多的研究進一步驗證?？傊醪窖芯拷Y(jié)果顯示，代謝酶MTHFR和轉(zhuǎn)運體ABCB1的基因突變會導(dǎo)致甲氨蝶呤嚴重不良反應(yīng)和耐藥的發(fā)生，在用藥前，建議檢測甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運和代謝基因分型，根據(jù)患者基因分型判斷是否可以首選甲氨蝶呤作為化療藥，制定個體化治療方案，以期提高療效、減少嚴重不良反應(yīng)和耐藥的發(fā)生，進一步縮短治療時間和節(jié)約醫(yī)療成本。