查 磊，仝宗軍，黃建春，李正鵬，郭 倩（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海國森生物科技有限公司，上海 201403）

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)又稱蘑菇、白蘑菇、洋蘑菇、紐扣蘑菇，味道鮮美，是一種富含氨基酸、蛋白質(zhì)的低脂肪健康食材[1]。近年來，隨著栽培面積的擴大和產(chǎn)量的增加，中國已成為雙孢蘑菇生產(chǎn)和出口大國之一[2]，但生產(chǎn)方式大多比較落后，菌種擴繁時，多采用固體逐級擴大的方式，發(fā)菌時間較長，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高[3-5]。

而采用液體菌種接種雙孢蘑菇栽培種可以有效解決這一問題。通過液體菌種接種栽培種可以提高雙孢蘑菇栽培菌種菌絲的生長速度，提高菌齡的一致性，對雙孢蘑菇菌種生產(chǎn)具有重要意義，可促進中國雙孢蘑菇的生產(chǎn)向高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化、周年化、工廠化的生產(chǎn)方向發(fā)展[6]。基于以上原因，筆者對雙孢蘑菇液體菌種進行研究，以期為雙孢蘑菇菌種生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

材料與方法

培養(yǎng)基的優(yōu)化

以生產(chǎn)常用的液體菌種配方（黃豆粉4 g、蔗糖20 g、K H2P O41 g、硫酸鎂0.5 g、水1 L）作為基準(zhǔn)配方，進行優(yōu)化。

培養(yǎng)時間

以基準(zhǔn)配方作為實驗配方，制作液體菌種，在500 mL的三角瓶中分裝250 mL 培養(yǎng)基，進行121℃、30 min 滅菌，待冷卻后，接種3 mm 菌塊10塊，在25 ℃、150 r/min 的搖床中進行培養(yǎng)，對液體菌種生長過程中第8～24 天菌絲干重的變化情況進行了記錄。

菌絲干重的稱量方法

濾紙烘干至恒質(zhì)量稱量，記為m1，取培養(yǎng)好的液體菌種，真空泵抽濾，得到菌絲體，菌絲體與濾紙烘干至恒質(zhì)量稱量，記為m2，即菌絲干重為m2-m1。

菌絲濕重的稱量方法

取培養(yǎng)好的液體菌種，進行過濾，將過濾得到的菌絲體3000 r/min 離心，棄上清，對菌絲濕重進行稱重，即為菌絲濕重。

適宜pH 篩選

對液體菌種的適宜pH進行確定，通過K2HPO4和KH2PO4作為緩沖劑對雙孢蘑菇液體菌種的pH 進行調(diào)整。K2HPO4和KH2PO4的的添加量如表1。并對其滅菌前后的進行了pH、菌絲干重以及菌絲形態(tài)進行了記錄。

表1 培養(yǎng)基K2HPO4 和KH2PO4 的添加量/（g/L）

適宜碳源篩選

對液體菌種的適宜碳源進行篩選，選擇蔗糖、紅糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇、海藻糖、乳糖、山梨醇、果糖作為糖源進行篩選，并依據(jù)干重和外觀形態(tài)對菌絲狀態(tài)做出評價。

圖1 不同培養(yǎng)時間菌絲干重的變化情況

適宜氮源篩選

對液體菌種的適宜氮源進行篩選，選擇有機氮源、無機氮源（硝態(tài)氮和銨態(tài)氮）作為氮源進行篩選，并依據(jù)干重和外觀形態(tài)對菌絲狀態(tài)做出評價。

氮源的復(fù)配

氮源是菌絲生長的重要營養(yǎng)，復(fù)合氮源在生產(chǎn)上較為常用，以玉米粉和黃豆粉作為材料對氮源進行復(fù)配，復(fù)配情況如表2，故主要以菌絲干重作為評判依據(jù)。

發(fā)酵罐發(fā)酵

根據(jù)篩選的結(jié)果選擇黃豆粉2 g、玉米粉2 g、蔗糖20 g、K2HPO41 g、硫酸鎂0.5 g、水1 L 作為最終配方，進行發(fā)酵罐發(fā)酵（6 L），接種量為250 mL，通氣量為4 L/min，培養(yǎng)溫度為25 ℃，培養(yǎng)12 天。對培養(yǎng)好的液體菌種進行過濾，對所得菌絲體進行3000 r/min 離心，棄上清，對菌絲濕重進行稱重。

表2 培養(yǎng)基玉米粉和黃豆粉的添加量/（g/L）

結(jié)果與分析

培養(yǎng)時間

對菌絲干重隨培養(yǎng)時間（8～24 天）延長的變化進行了研究，并對不同培養(yǎng)時間的干重進行多重比較。從結(jié)果（圖1）可以看出在第9～16 天菌絲干重較大，且無顯著差異（P＜0.05），在第12 天達(dá)到最大值，16 天后菌絲干重開始減少。因此，根據(jù)干重的最大值選擇以12 天作為菌絲培養(yǎng)的最佳時間。

pH

試驗結(jié)果表明隨著K2HPO4增加、KH2PO4的減少，pH 逐漸增大，且滅菌前后pH 無較大變化（圖2a），但各個pH 梯度間存在顯著差異。結(jié)合干重（圖2b）的結(jié)果，配方U 顯著高于其他配方，結(jié)合外觀形態(tài)（圖2c） 的變化情況，配方U 菌絲濃密，故選擇不添加K2HPO4、添加1 g KH2PO4。

碳源

試驗結(jié)果表明，蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、果糖作為糖源菌絲干重（圖3）顯著高于其他碳源（P＜0.05），均可作為生產(chǎn)配方的碳源，但根據(jù)外觀形態(tài)（圖3）結(jié)果可以看出，葡萄糖作為碳源的菌絲產(chǎn)生沉淀，且顆粒大，故蔗糖、可溶性淀粉、果糖作為備選碳源，考慮到蔗糖較為廉價，且生產(chǎn)效果上與可溶性淀粉、果糖無明顯差別，故選擇蔗糖作為碳源。

氮源

試驗結(jié)果表明，黃豆粉、麩皮粉、玉米粉作為氮源菌絲干重顯著高于其他氮源（P＜0.05），均可作為氮源，但根據(jù)外觀形態(tài)（圖4）結(jié)果可以看出，麩皮粉作為氮源菌絲產(chǎn)生沉淀較黃豆粉和玉米粉較差，且顆粒大，故黃豆粉、玉米粉作為備選氮源。

氮源的復(fù)配

圖2 不同pH 處理菌絲干重和外觀的變化情況

圖3 不同碳源干重、菌絲形態(tài)情況

圖4 不同氮源干重、菌絲形態(tài)情況

試驗結(jié)果表明，以玉米粉和黃豆粉作為氮源對其進行復(fù)配，其菌絲生長狀況基本一致，故主要以菌絲干重（圖5）作為評判依據(jù)。雖然配方A、C、D、E 間無顯著差異，但配方C菌絲干重量最大，故選擇配方C 的氮源作為篩選氮源，氮源確定為玉米粉2 g，黃豆粉2 g。

發(fā)酵罐實驗

使用優(yōu)化后的配方進行發(fā)酵實驗，可以較好地發(fā)酵雙孢蘑菇液體菌種，發(fā)酵好的菌種菌球大小均勻，且菌球密度大，6 L 的發(fā)酵液可以獲得濕重480 g 的菌絲，且液體菌種發(fā)酵的穩(wěn)定性更好，菌絲發(fā)酵情況如圖6。

結(jié)論與討論

先進的制種技術(shù)對中國食用菌的生產(chǎn)和國際貿(mào)易具有重要影響。液體菌種因其培養(yǎng)周期短、菌絲體生長條件相同、菌齡一致、出菇整齊、現(xiàn)蕾快、成本低、純度高、活性強等優(yōu)點，有利于高效率、工廠化、規(guī)?；耘郲7]，雙孢蘑菇液體菌種的研究可以為雙孢蘑菇栽培種的生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

數(shù)據(jù)表明，菌絲干重隨著培養(yǎng)時間的延長，基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與紅平菇[8]、木蹄層孔菌[9]、美味牛肝菌[10]的研究結(jié)果具有一致性，這可能是由于食用菌菌種接種液體培養(yǎng)基，適應(yīng)了液體培養(yǎng)基后，菌絲生長速度加快，因此菌絲的生物量上升；但當(dāng)液體培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲量達(dá)到最大值后，隨著培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)因營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多而不能維持細(xì)胞增加與死亡的平衡時，發(fā)酵液內(nèi)的菌絲便進入衰亡期[11]。另外，pH 保持在中性偏堿的時候最適合菌絲生長，這與雙孢蘑菇培養(yǎng)料的最適pH 基本一致。同時，在木腐菌栽培過程中，玉米粉，黃豆粉作為工廠化生產(chǎn)液體菌種的主要原材料[7]，為雙孢蘑菇液體菌種工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

圖5 菌絲干重情況

圖6 菌絲發(fā)酵狀況

試驗在原有木腐菌配方的基礎(chǔ)上，對雙孢蘑菇的培養(yǎng)時間、pH、碳氮源進行了優(yōu)化，根據(jù)試驗結(jié)果選擇黃豆粉2 g、玉米粉2 g、蔗糖20 g、K2HPO41 g、硫酸鎂0.5 g、水1 L作為最終配方，培養(yǎng)時間選擇為12 天。