馬嘯，丁娟，任志剛，李臻，韓麗萍，禚志紅，趙先蘭

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 質(zhì)量控制處，河南 鄭州 450052)

甲狀腺功能減退是產(chǎn)婦妊娠期常見(jiàn)并發(fā)癥。甲狀腺功能減退增加不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)[1]，影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[2]，還可能通過(guò)影響后代腸道菌群從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。嬰兒期腸道菌群的定植和建立與嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)狀況及免疫系統(tǒng)的成熟密切相關(guān)[3-6]。目前有關(guān)妊娠合并甲狀腺功能減退對(duì)子代腸道菌群定植影響的基礎(chǔ)研究報(bào)道較少。本研究擬采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)，分析妊娠合并甲狀腺功能減退孕婦所生嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群與產(chǎn)前檢查無(wú)并發(fā)癥孕婦所生嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群的差異，了解妊娠合并甲狀腺功能減退對(duì)子代腸道菌群定植的影響，為胎兒娩出后接受益生菌干預(yù)，從而減少其對(duì)子代遠(yuǎn)期的影響提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年7月至2018年8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的孕婦孕期產(chǎn)檢診斷合并甲狀腺功能減退、足月出生的7例嬰兒為觀察組，入組孕婦和嬰兒無(wú)其他并發(fā)癥，妊娠甲狀腺功能減退孕婦接受統(tǒng)一的內(nèi)科治療。根據(jù)觀察組嬰兒的分娩方式和喂養(yǎng)方式進(jìn)行1∶1配對(duì)選取同期孕婦產(chǎn)前檢查無(wú)并發(fā)癥、足月出生的7例嬰兒作為對(duì)照組。妊娠合并甲狀腺功能減退的診斷：參照2019年中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)分會(huì)制定的《妊娠和產(chǎn)后甲狀腺疾病診治指南》[7]推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。入選標(biāo)準(zhǔn)：出生胎齡為37～42周；出生體質(zhì)量為2 500～4 000 g。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠前有確診的甲狀腺疾病史；嚴(yán)重心、肝、腎等疾??；孕期合并嚴(yán)重高血壓、糖尿病。嬰兒父母自愿參與本研究并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1臨床信息收集 查閱鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)，收集兩組嬰兒性別、胎齡、出生體質(zhì)量、孕婦孕期體質(zhì)量增長(zhǎng)、孕婦產(chǎn)前體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)等臨床資料。

1.2.2標(biāo)本采集 收集嬰兒出生后1個(gè)月的糞便標(biāo)本。用采樣器采集2～3 g新鮮糞便，置于無(wú)菌糞便盒內(nèi)，使用液氮罐轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.3糞便DNA提取、擴(kuò)增和高通量測(cè)序 采用化學(xué)裂解法裂解糞便樣本細(xì)胞膜及細(xì)胞核膜，提取標(biāo)本的總DNA，以每份糞便樣本提取的DNA為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)特異性擴(kuò)增16SrRNA基因的V3～V4區(qū)域。正向引物：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’。反向引物：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’。不同樣本的PCR產(chǎn)物按相同比例進(jìn)行混合，于Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.4生物信息學(xué)分析 在門(mén)水平和屬水平進(jìn)行豐度分析，比較每個(gè)細(xì)菌類群相對(duì)水平的差異。另采用線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)效應(yīng)值(LDA effect size，LEfSe)方法來(lái)確定觀察組嬰兒出生后1個(gè)月特有的腸道微生物特征，LDA>3為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算樣品多樣性如Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)及ACE指數(shù)，并比較兩組的差異性。多樣性分析用于比較兩組菌群結(jié)構(gòu)的差異，主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)中樣本距離越接近，表示菌群結(jié)構(gòu)越接近。對(duì)群落差異進(jìn)行Adonis分析，R2表示不同分組對(duì)樣品差異的解釋度，R2越大表示分組對(duì)差異的解釋度越高。通過(guò)置換檢驗(yàn)獲得P值，P值越小，表明組間差異越顯著。

2 結(jié)果

2.1 一般情況兩組嬰兒性別、胎齡、出生體質(zhì)量、孕婦孕期體質(zhì)量增長(zhǎng)、孕婦產(chǎn)前BMI、分娩方式、喂養(yǎng)方式比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 16S rRNA測(cè)序結(jié)果通過(guò)對(duì)兩組糞便樣本進(jìn)行高通量測(cè)序后，共得到466 900條有效序列，基于有效序列以超過(guò)97%相似性進(jìn)行OTUs聚類，共注釋到1 099個(gè)OTUs。分析兩組間共有、特有的OTUs，繪制成韋恩圖。見(jiàn)圖1。

2.3 嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群門(mén)水平結(jié)構(gòu)分布兩組主要的菌門(mén)有厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。見(jiàn)圖2A。兩組放線菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)豐度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2B。

圖1 基于OUTs的韋恩圖

A為嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群門(mén)水平豐度；B為嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群門(mén)水平差異菌。

2.4 嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群屬水平結(jié)構(gòu)分布兩組主要的菌屬主要有鏈球菌屬、克雷伯菌屬、雙歧桿菌屬、埃希菌-志賀菌屬、擬桿菌屬、韋榮球菌屬、乳桿菌屬、狹義梭菌屬、副桿菌屬和葡萄球菌屬。見(jiàn)圖3A。兩組雙歧桿菌屬和韋榮球菌屬豐度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3B。

A為嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群屬水平豐度；B為嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群屬水平差異菌。

2.5 嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群LEfSe分析采用非參數(shù)因子秩和檢驗(yàn)檢測(cè)具有顯著豐度差異的特征，找到與豐度有顯著性差異的類群，采用LDA估算每個(gè)物種豐度對(duì)差異效果的影響。以LDA>3為標(biāo)準(zhǔn)篩選本次分析中的特征性差異菌。見(jiàn)圖4。

2.6 嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群與多樣性觀察組和對(duì)照組腸道菌群多樣性Shannon指數(shù)分別為(2.25±0.07)和(2.03±0.21)，Simpson指數(shù)分別為(0.17±0.01)和(0.23±0.04)，Chao1指數(shù)分別為(109.94±13.22)和(101.67±12.91)，ACE指數(shù)分別為(121.02±13.59)和(104.01±12.58)，兩組各指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。多樣性分析中，PCoA結(jié)果顯示兩組腸道菌群結(jié)構(gòu)接近。見(jiàn)圖6。Adonis分析顯示兩組腸道菌群結(jié)構(gòu)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R2=0.081，P=0.372)。

圖4 嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群LEfSe分析

A為Shannon指數(shù)；B為Simpson指數(shù)；C為Chao1指數(shù)；D為ACE指數(shù)。

圖6 兩組嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群PCoA結(jié)果

3 討論

腸道菌群的定植影響嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育和健康狀況，與成年后肥胖[8-9]、糖尿病[5,10]等的發(fā)生密切相關(guān)。此外，腸道菌群還可通過(guò)腸黏膜免疫、內(nèi)分泌和迷走神經(jīng)途徑參與腦-腸軸活動(dòng)，影響大腦功能及其與大腦關(guān)聯(lián)的一些宿主行為，如焦慮、 抑郁等[11-12]。母親是嬰兒生命早期菌群定植的主要來(lái)源，分娩方式[13-14]、 喂養(yǎng)方式[14-15]等因素均會(huì)影響嬰兒的腸道菌群組成、豐度及分布情況。研究表明，母親孕期的糖脂代謝水平與嬰兒腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[16]。Collado等[17]研究發(fā)現(xiàn)，16例孕前肥胖孕婦的子代出生后6個(gè)月擬桿菌屬、葡萄球菌屬數(shù)量顯著多于26例孕前體質(zhì)量正常孕婦的子代。既往研究表明孕婦妊娠合并甲狀腺功能減退與脂肪、糖類代謝密切相關(guān)[18-19]。本研究首次報(bào)道了孕婦妊娠合并甲狀腺功能減退影響嬰兒早期腸道菌群的定植和形成，提示妊娠合并甲狀腺功能減退是影響嬰兒腸道菌群的重要因素。

本研究結(jié)果顯示，腸道菌群在妊娠合并甲狀腺功能減退孕婦所生嬰兒中變化顯著，兩組腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，不同菌屬存在豐度差異。本研究對(duì)兩組嬰兒糞便樣本中微生物的多樣性進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)兩組腸道菌群多樣性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明兩組嬰兒微生物群落的豐度和多樣性無(wú)明顯差異。兩組糞便中優(yōu)勢(shì)菌群以厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主，但具體到屬的水平上則出現(xiàn)較大的個(gè)體差異性。觀察組雙歧桿菌屬豐度低于對(duì)照組。雙歧桿菌屬是母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌，其作為腸道中常見(jiàn)的有益菌，在維持腸道功能平衡、保證宿主正常的新陳代謝等方面發(fā)揮著重要的作用[20]。雙歧桿菌屬減少所引起的腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致許多代謝性疾病的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌屬可以有效改善糖類代謝，降低高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的內(nèi)毒素水平，減輕腸道炎癥[21-22]。同時(shí)，觀察組腸道菌群中韋榮球菌屬豐度高于對(duì)照組。韋榮球菌屬是革蘭陰性厭氧微小球菌，屬于厚壁菌門(mén)，是重要的條件致病菌[23]，參與構(gòu)成人類口腔、泌尿生殖器、呼吸道及腸道內(nèi)的正常菌群組成，易導(dǎo)致齲齒、腦膜炎、硬膜外積液、心內(nèi)膜炎等疾病[24-26]。兩組嬰兒在腸道菌群組成上存在較大差異。

妊娠合并甲狀腺功能減退可影響嬰兒出生后1個(gè)月腸道菌群，這可能是引起子代腸道菌群紊亂的原因。目前對(duì)妊娠合并甲狀腺功能減退孕婦所生嬰兒早期腸道菌群定植的研究相對(duì)較少。本研究對(duì)妊娠合并甲狀腺功能減退孕婦所生嬰兒出生后1個(gè)月的腸道菌群進(jìn)行分析，加深了對(duì)嬰兒期腸道菌群定植的認(rèn)識(shí)，為深入了解嬰兒腸道菌群的早期定植奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為防治嬰兒腸道菌群紊亂提供了新的著眼點(diǎn)，為胎兒娩出后接受益生菌干預(yù)，從而降低孕婦妊娠合并甲狀腺功能減退對(duì)子代遠(yuǎn)期的影響提供參考依據(jù)。