馮玎琦，單文琪，毛佳慧，舒揚(yáng)，汪毅，汪雪峰

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

哮喘是一種全球性常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其本質(zhì)是氣道性炎癥，主要病理學(xué)特征是氣道的高反應(yīng)性和結(jié)構(gòu)重塑。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，不同患者之間存在顯著差異，涉及多種免疫細(xì)胞、免疫分子以及多條炎癥相關(guān)的信號(hào)通路參與[1]。因此，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療對(duì)緩解哮喘病癥尤為重要?，F(xiàn)有研究表明，CD4+T細(xì)胞亞群失衡及相關(guān)細(xì)胞因子異常釋放是發(fā)生氣道損傷、炎癥反應(yīng)和功能障礙的主要原因。其中輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17,Th17細(xì)胞)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg細(xì)胞)失衡能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞在肺組織中的活化和募集，該機(jī)制在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2-3]。

Th17和Treg細(xì)胞具有相互拮抗的免疫學(xué)功能。Treg細(xì)胞負(fù)責(zé)維持自身耐受、抑制自身免疫，而Th17細(xì)胞則參與炎癥的誘導(dǎo)[4]。在正常情況下兩者共同維持機(jī)體免疫系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，但在疾病狀態(tài)下，該平衡被打破且易向Th17細(xì)胞方向偏移。因此，Th17/Treg細(xì)胞失衡被公認(rèn)為是導(dǎo)致和加劇過敏性或自身免疫性疾病的重要原因之一[5]。

日本血吸蟲熱激蛋白來源多肽SJMHE1是一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的非特異性小分子肽，包含多個(gè)人和小鼠CD4+T細(xì)胞表位。前期研究發(fā)現(xiàn)，SJMHE1不僅可以有效抑制小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)，還可以減輕膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)和毒副反應(yīng)[6-7]。本研究旨在探索SJMHE1對(duì)Th17/Treg細(xì)胞平衡的調(diào)控以及在小鼠過敏性哮喘治療中的作用，為今后的臨床轉(zhuǎn)化提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體級(jí)近交系BALB/c小鼠18只，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心[生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2017-0007]，飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循江蘇大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)指南協(xié)議。

1.2主要試劑 小鼠CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒(加拿大STEMCELL公司，批號(hào)：19852)。小鼠T細(xì)胞活化試劑盒(德國(guó)Miltenyi公司，批號(hào)：130-093-627)。多肽SJMHE1，序列為VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED，上海淘普生物公司合成并純化。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗鼠CD4抗體，藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標(biāo)記的抗鼠白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17抗體，PE標(biāo)記的抗鼠叉頭框蛋白P3(forkhead box protein P3,FoxP3)抗體，別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin,APC)標(biāo)記的抗鼠CD25抗體(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：11-0041-82、12-9171-80、12-5773-80、17-0251-81)。佛波酯/離子霉素混合液，布雷非德菌素A/莫能霉素混合液(杭州聯(lián)科生物公司，批號(hào)：CS1001、CS1002)。細(xì)胞固定/破膜試劑盒(美國(guó)BD公司，批號(hào)：554714)。FoxP3/轉(zhuǎn)錄因子染色試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：00-5523-00)。第一鏈cDNA高效合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)GeneCopoeia公司，批號(hào)：QP056)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒(美國(guó)GeneCopoeia公司，批號(hào)：QP031)。小鼠組織解離試劑盒(德國(guó)Miltenyi公司，批號(hào)：130-095-927)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫磁珠法分離CD4+T細(xì)胞 在無菌環(huán)境中摘取1只正常小鼠脾臟置于篩網(wǎng)中，充分研磨過濾，收集細(xì)胞懸液在4 ℃、500×g的條件下離心5 min，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。用含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)重懸細(xì)胞至濃度為1×108cells/mL，置于5 mL聚苯乙烯圓底試管內(nèi)，加入50 μL/mL的分選混合物試劑，充分混勻，室溫孵育10 min。加入75 μL/mL 的分選磁珠，充分混勻，室溫孵育5 min。加入PBS至2.5 mL，將圓底試管插入磁鐵內(nèi)，室溫靜置3 min。將富集的細(xì)胞懸液倒入新的試管中，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。

1.3.2CD4+T細(xì)胞的體外培養(yǎng) 選用24孔培養(yǎng)板，每孔接種1×106個(gè)分選出的CD4+T細(xì)胞，每孔加入10 μL預(yù)混小鼠T細(xì)胞活化試劑。分別加入0、0.5、1、1.5 μg/mL SJMHE1。置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)4 d。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞 分別取1×106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞用250 μL含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基重懸，加入1 μL佛波酯/離子霉素混合液和1 μL布雷非德菌素A/莫能霉素混合液，充分混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。收集細(xì)胞置于1.5 mL離心管中，用100 μL PBS重懸。加入FITC標(biāo)記的抗鼠CD4抗體0.5 μL，充分混勻，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌1遍。加入1 mL細(xì)胞破膜液，充分混勻，4 ℃避光孵育15 min，緩沖液洗滌1遍。將細(xì)胞重懸于100 μL緩沖液中，加入PE標(biāo)記的抗鼠IL-17抗體0.6 μL，充分混勻，4 ℃避光孵育30 min，緩沖液洗滌2遍。將細(xì)胞重懸于300 μL緩沖液中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞(CD4+IL-17+)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞 分別取1×106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞置于1.5 mL離心管中，用100 μL PBS重懸。加入FITC標(biāo)記的抗鼠CD4抗體0.5 μL，APC標(biāo)記的抗鼠CD25抗體0.5 μL，充分混勻，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌1遍。加入1 mL細(xì)胞破膜液，充分混勻，4 ℃避光孵育30 min，緩沖液洗滌1遍。將細(xì)胞重懸于100 μL緩沖液中，加入PE標(biāo)記的抗鼠FoxP3抗體1 μL，充分混勻，4 ℃避光孵育60 min，緩沖液洗滌2遍。將細(xì)胞重懸于300 μL緩沖液中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞(CD4+CD25+FoxP3+)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)視黃酸相關(guān)核孤兒受體γt(retinoic acid-related orphan receptor γt,RORγt)和FoxP3 mRNA 收集培養(yǎng)細(xì)胞，提取總RNA，測(cè)定總RNA含量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置：25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參對(duì)目的基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。引物分別如下：GAPDH引物(序列號(hào)MQP027158)、RORγt引物(序列號(hào)MQP067542)、FoxP3引物(序列號(hào)MQP067272)。PCR反應(yīng)條件設(shè)置：95 ℃ 30 s預(yù)變性，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 30 s退火和延伸，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt比較法進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6哮喘小鼠模型的建立 將剩余的15只小鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為 PBS組、卵白蛋白(ovalbumin,OVA)組和OVA+SJMHE1組，每組5只。分別在第1、8和15天給予哮喘小鼠腹腔注射含50 μg OVA和2 mg 10%氫氧化鋁的混合溶液，同時(shí)正常對(duì)照小鼠腹腔注射等量PBS。從第22天開始，哮喘小鼠使用2% OVA溶液進(jìn)行霧化，每日1次，每次30 min，持續(xù)至第28天結(jié)束，同時(shí)正常對(duì)照小鼠使用PBS進(jìn)行霧化。造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、頭面部瘙癢、口唇發(fā)紺、前肢縮抬等陽(yáng)性反應(yīng)。此外，分別在第1、15和29天，給予哮喘小鼠腹腔注射含10 μg SJMHE1的多肽乳化劑。飼養(yǎng)小鼠至第36天。

1.3.7肺組織病理學(xué)分析 取小鼠左肺組織，用4%的甲醛固定，石蠟包埋并制成4 μm厚度切片。融蠟后分別置于二甲苯Ⅰ和Ⅱ中脫蠟，各10 min，等比例二甲苯和100%乙醇混合溶液浸泡 2 min，后置于100%、100%、80%乙醇中脫水，各5 min。蘇木精染液染色5 min后流水沖洗，1%鹽酸乙醇浸泡30 s后流水沖洗，1%伊紅染液染色30 s后流水沖洗。將切片分別置于95%、95%、100%、100%乙醇中脫水，各1 min，后置于二甲苯Ⅰ和Ⅱ中透明，各3 min。中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.3.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-17A和IL-10 mRNA 取小鼠右肺組織，制備單細(xì)胞懸液。引物分別如下：GAPDH引物(序列號(hào)MQP027158)、IL-17A引物(序列號(hào)MQP032565)、IL-10引物(序列號(hào)MQP029453)。檢測(cè)方法與標(biāo)題1.3.5相同。

2 結(jié) 果

2.1SJMHE1作用對(duì)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的影響 在一定濃度范圍內(nèi)，隨著SJMHE1濃度的增加，Th17細(xì)胞的比例不斷降低，Treg細(xì)胞比例不斷升高，見圖1。不同SJMHE1濃度組Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中0.5、1和1.5 μg/mL SJMHE1組Th17細(xì)胞比例均低于0 μg/mL SJMHE1組(P<0.05)；1 μg/mL和1.5 μg/mL SJMHE1組Treg細(xì)胞比例高于0 μg/mL SJMHE1組(P<0.05)，0.5 μg/mL SJMHE1組Treg細(xì)胞比例與0 μg/mL SJMHE1組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同SJMHE1濃度作用下Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例比較

Th17：輔助性T細(xì)胞17；Treg：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；FoxP3：叉頭框蛋白P3

2.2SJMHE1作用對(duì)轉(zhuǎn)錄因子RORγt和FoxP3 mRNA表達(dá)水平的影響 不同SJMHE1濃度組轉(zhuǎn)錄因子RORγt和FoxP3 mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中1 μg/mL和1.5 μg/mL SJMHE1組RORγt mRNA均低于0 μg/mL SJMHE1組(P<0.05)，F(xiàn)oxP3 mRNA均高于0 μg/mL SJMHE1組(P<0.05)，0.5 μg/mL SJMHE1組與0 μg/mL SJMHE1組RORγt和FoxP3 mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同SJMHE1濃度作用下轉(zhuǎn)錄因子RORγt和FoxP3 mRNA表達(dá)水平比較

2.3肺組織病理學(xué)改變 PBS組小鼠肺部支氣管以及肺泡結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞排列整齊，管腔光滑，黏膜下無平滑肌增生。與PBS組相比，OVA組小鼠肺部支氣管管壁明顯增厚，管腔狹窄變形，黏膜下平滑肌增生明顯。肺泡間隔增多，支氣管周圍以及肺泡間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。OVA+SJMHE1組小鼠肺部支氣管結(jié)構(gòu)異常、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變較OVA組明顯減輕。見圖2。

2a：PBS組；2b：OVA組；2c：OVA+SJMHE1組

2.4肺組織細(xì)胞因子IL-17A和IL-10 mRNA表達(dá)水平的改變 各組小鼠肺組織細(xì)胞因子IL-17A和IL-10 mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中OVA組IL-17A mRNA高于PBS組(P<0.05)，OVA+SJMHE1組低于OVA組(P<0.05)；OVA組IL-10 mRNA低于PBS組(P<0.05)，OVA+SJMHE1組高于OVA組(P<0.05)，OVA+SJMHE1組IL-17A和IL-10 mRNA與PBS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠肺組織細(xì)胞因子IL-17A和IL-10 mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

現(xiàn)有研究認(rèn)為，在過敏性或自身免疫性疾病的發(fā)病過程中，來自外界的病原體可與自身抗原形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而緩解自身免疫性反應(yīng)[8]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在蠕蟲感染的高發(fā)區(qū)，過敏性或自身免疫性疾病的發(fā)病率較低。因此，人們開始關(guān)注蠕蟲及其相關(guān)分子在疾病治療中的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制[9]。為減少或避免蠕蟲及蠕蟲來源的免疫調(diào)節(jié)大分子在抗感染治療中引起的不良反應(yīng)，研究者著力尋找精準(zhǔn)的小分子物質(zhì)，力求該小分子具有抗炎效應(yīng)的同時(shí)能夠提高治療的安全性。例如，絲狀線蟲來源的小分子物質(zhì)ES-62，現(xiàn)已被證實(shí)可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群和抑制與生態(tài)失調(diào)相關(guān)的慢性炎癥來保護(hù)腸道和胃黏膜[10]。同時(shí)它還可以有效改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病癥，抑制破骨細(xì)胞的形成[11]。旋毛蟲成蟲小分子提取物對(duì)小鼠過敏性哮喘有積極的預(yù)防和治療作用，主要表現(xiàn)為緩解由OVA引起的氣道炎癥反應(yīng)，這與Th2細(xì)胞相關(guān)因子IL-4分泌的降低以及Treg細(xì)胞相關(guān)因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β分泌的增加密切相關(guān)[12]。

本課題研究的多肽SJMHE1是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，多CD4+T細(xì)胞表位的特點(diǎn)使該分子易于在特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。SJMHE1能夠通過促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖并升高抗炎細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的表達(dá)而有效抑制遲發(fā)性超敏反應(yīng)。此外，SJMHE1還可以減輕膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)和毒副反應(yīng)，主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和軟骨破壞的減少，不引起肝、腎功能損傷和主要臟器的病理學(xué)改變。因此，具有抗炎效應(yīng)和高安全性的小分子多肽SJMHE1具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

有研究對(duì)哮喘患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞的分化進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵性細(xì)胞因子IL-1β和IL-6均呈高表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子RORγt、RORα、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3以及干擾素調(diào)節(jié)因子4均參與Th17細(xì)胞的分化過程。同時(shí)，Th17細(xì)胞過表達(dá)IL-17A和IL-17F，刺激嗜酸粒細(xì)胞增多，加重中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)[13]。Treg細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β則涉及Smad2/3相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控[14]。本研究在體外研究發(fā)現(xiàn)了SJMHE1對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子具有相反的調(diào)節(jié)作用，證實(shí)SJMHE1可以調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞平衡。然后利用OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型進(jìn)一步探討SJMHE1對(duì)過敏性哮喘的作用，結(jié)果顯示，SJMHE1治療顯著抑制了小鼠氣道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，肺組織中促炎細(xì)胞因子IL-17A的分泌減少，同時(shí)抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌增加。

臨床研究證實(shí)，維持Th17/Treg細(xì)胞平衡在靶向免疫治療方面已取得顯著成效，多數(shù)已作為臨床上治療過敏性或自身免疫性疾病的候選方法[15-17]。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路的靶向治療是設(shè)計(jì)治療哮喘新藥的有效策略。目前已有多種生物分子和藥物成分通過靶向調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡對(duì)哮喘癥狀發(fā)揮抑制作用[18]。有研究顯示，在體外給予抗程序性細(xì)胞死亡受體1刺激可降低哮喘患者Th17細(xì)胞比例和RORγt mRNA表達(dá)，提高Treg比例和FoxP3 mRNA表達(dá)。在小鼠哮喘模型中，也進(jìn)一步證實(shí)抗程序性細(xì)胞死亡受體1治療對(duì)Th17/Treg細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)作用[19]。黃淮芪可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌調(diào)控Treg/Th17細(xì)胞平衡，并改變哮喘小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3和RORγt mRNA的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抑制哮喘發(fā)生發(fā)展的作用[20]。此外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3作為一種內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA，靶向miR-17/ROR 295t，調(diào)控哮喘患者Treg/Th17細(xì)胞平衡[21]。本課題研究結(jié)果與上述研究結(jié)果趨勢(shì)一致，為SJMHE1通過調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞平衡緩解哮喘小鼠氣道炎癥提供了有力依據(jù)。未來將著重關(guān)注SJMHE1對(duì)相關(guān)靶基因的調(diào)控，明確其作用機(jī)制。

綜上所述，日本血吸蟲來源的小分子多肽SJMHE1具有抑制Th17細(xì)胞比例及其相關(guān)分子表達(dá)、促進(jìn)Treg細(xì)胞比例及其相關(guān)分子表達(dá)的作用，可以通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡改善過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)，為過敏性哮喘的治療提供了新的靶點(diǎn)和依據(jù)。