（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000）

微藻生長速度快，可積累大量的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等，生物質(zhì)產(chǎn)出效率比傳統(tǒng)植物高，有極為重要的應(yīng)用價(jià)值[1]。微藻培養(yǎng)可采用開放和封閉等方式，其中開放式培養(yǎng)是利用圓形或橢圓形的跑道培養(yǎng)池在戶外進(jìn)行，成本低，但受自然因素影響大，尤其是水分蒸發(fā)量較大，產(chǎn)量較低且不穩(wěn)定；封閉式培養(yǎng)一般在密閉玻璃，或硬質(zhì)透明塑料管道、平板式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行，對培養(yǎng)參數(shù)的控制更為嚴(yán)格，產(chǎn)量和質(zhì)量均較高[2]，但所需設(shè)備和配套投入成本較高。微藻也可用發(fā)酵罐在無菌條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件可進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，單位體積的微藻產(chǎn)量較高，但發(fā)酵罐的投入及維護(hù)運(yùn)行費(fèi)用、培養(yǎng)基成本均高于開放式和封閉式培養(yǎng)[3]。

開放式培養(yǎng)是目前微藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中采用的主要培養(yǎng)方式，多年來，學(xué)界一直試圖改進(jìn)開放式培養(yǎng)的體系。Doucha等[4]建立了一種戶外高密度培養(yǎng)微藻的淺層裝置，通過傾斜的平板及擋板提高光合作用和二氧化碳利用效率，培養(yǎng)的小球藻產(chǎn)量（干物質(zhì)）達(dá)到11.1 g/(m2·d)[5-8]。Wiley等[9]推出OMEGA培養(yǎng)微藻系統(tǒng)[一種漂浮在海洋水面上的光生物反應(yīng)器 (PBR)]，利用岸上排放的污水和富含二氧化碳的煙氣，通過渦輪葉片混合循環(huán)藻液，在沉淀室收集微藻并添加新鮮廢水來補(bǔ)充營養(yǎng)，產(chǎn)量可達(dá)1.3 g/(m2·d)。Zhu等[10-15]用充氣膜在海面上形成一個封閉式的微藻培養(yǎng)體系，通過碳酸鹽池固定空氣中的二氧化碳提供碳源，由周圍水體環(huán)境調(diào)節(jié)水溫，就地利用淡化海水或者養(yǎng)殖廢水進(jìn)行藻類培養(yǎng)，已應(yīng)用于鹽藻（Dunaliella salina）及螺旋藻（Spirulina） 等微藻的大規(guī)模培養(yǎng)試驗(yàn)。Yan等[16]建立一種平板光反應(yīng)器（Flat-plate photobioreactor，F(xiàn)PPBR），在反應(yīng)器內(nèi)加入傾斜擋板，使藻液螺旋流動，在藻細(xì)胞生長過程中用閃光效應(yīng)提高微藻產(chǎn)量，小球藻產(chǎn)量可達(dá)21.9 g/(m2·d)[17]。

受生產(chǎn)成本的限制，微藻產(chǎn)業(yè)仍處于起步階段，需降低成本，方可擴(kuò)大微藻產(chǎn)業(yè)規(guī)模。小球藻（Chlorella）光合效率高，繁殖速度快，對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，應(yīng)用于食品、餌料、飼料、生物能源、生物固碳、污水處理等多個領(lǐng)域[18]。小球藻的基礎(chǔ)和應(yīng)用已有大量研究，部分小球藻藻種已完成全基因組測序[19-21]。本研究建立一種新的微藻戶外開放式培養(yǎng)體系，以小球藻（Chlorella sorokiniana）為模式藻種，探究該體系培養(yǎng)的小球藻基本特征和培養(yǎng)參數(shù)，為該培養(yǎng)體系的推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小球藻藻種UTEX-1230購于美國德州大學(xué)UTEX藻種庫，保存及活化藻種所用培養(yǎng)基為TAP（Tris-acetate-phosphate）[22]。固體培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂。藻種采用逐級擴(kuò)大培養(yǎng)制備，從斜面到平板活化藻種，一級藻種無菌培養(yǎng)從單克隆到20 mL，二級藻種無菌培養(yǎng)至300 mL，三級藻種非滅菌培養(yǎng)至10 L，生產(chǎn)種非滅菌培養(yǎng)至50 L。

1.2 微藻的浮法培養(yǎng)體系

在綜合考慮現(xiàn)有培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，根據(jù)微藻農(nóng)業(yè)化培養(yǎng)的理念，設(shè)計(jì)一種平面、開放和淺層（Flat,open and shallow,FOS，簡稱浮法）的培養(yǎng)體系（圖1）。所用容器為農(nóng)用塑料筒袋，根據(jù)所需體積裁定袋子長度，將袋子平放在臺面或地面上，兩端下部加上墊板，在中間形成容器，用于盛放微藻培養(yǎng)液。室內(nèi)培養(yǎng)時(shí)用日光燈照射，溫室或室外培養(yǎng)時(shí)為自然光照射。

圖1 微藻浮法培養(yǎng)體系Fig.1 FOS system for microalgae culture

1.3 不同溫度對小球藻生長的影響

液體培養(yǎng)基為TAP，在培養(yǎng)基袋外敷以冰袋或熱水袋調(diào)整溫度。設(shè)置溫度為20、25、30、35、40 ℃，每隔10～20 min測定并調(diào)整培養(yǎng)基溫度，確保溫度基本穩(wěn)定（±2 ℃）。培養(yǎng)液夜間自然降至室溫（17～20 ℃）。起始D(750 nm)為0.5（±0.05），照度為60 μmol·m-2·s-1，光/暗周期為12 h/12 h，在0、6、12、24、36 h時(shí)取樣，拍照記錄小球藻表型變化，測定小球藻培養(yǎng)液在750 nm下的光密度 [D(750 nm)]和pH，由于D(750 nm)與小球藻生物量及細(xì)胞數(shù)呈線性關(guān)系，故采用D(750 nm)值比較不同處理的生物量。

1.4 不同照度對小球藻生長的影響

在步入式光照培養(yǎng)箱內(nèi)（RBC-1000型，寧波江南儀器廠）通過藻液與光源的距離調(diào)節(jié)照度，設(shè)置7個照度，分別為90、45、20、10、5、2.5 μmol·m-2·s-1及暗處理。起始培養(yǎng)光密度為0.5（±0.05），光/暗周期為12h/12h，溫度為30 ℃，培養(yǎng)7 d，每天取樣，拍照記錄表型變化，測定D(750 nm)和pH。

1.5 培養(yǎng)基中的碳、氮源對小球藻生長的影響

以TAP為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別設(shè)置缺氮（不含氯化銨），缺碳（不含醋酸）和缺碳、氮（不含氯化銨和醋酸）的培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻，正對照為TAP培養(yǎng)基，負(fù)對照為自來水，培養(yǎng)7 d，取樣測量方式同1.4。

1.6 培養(yǎng)基pH值對小球藻生長的影響

以TAP為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，去除Tris（TAP-Tris）用乙酸調(diào)節(jié)pH或不調(diào)節(jié)pH處理，正負(fù)對照分別為TAP培養(yǎng)基和自來水，在每天取樣后調(diào)pH，取樣測量方式同1.4。

1.7 戶外900 L浮法培養(yǎng)試驗(yàn)

900 L戶外培養(yǎng)于2020年9月中下旬，在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)稻竹園微藻實(shí)驗(yàn)基地（115°46′N，38°87′E。戶外試驗(yàn)期間日出時(shí)間平均為6:09，日落時(shí)間平均為18:08，光/暗周期約為12h/12h，日間最高氣溫平均為22.6 ℃）進(jìn)行，試驗(yàn)內(nèi)容主要有培養(yǎng)體系的建立，包括平整地面、鋪設(shè)塑料筒袋、培養(yǎng)基配置、pH檢測、溫度檢測等，并根據(jù)氣象資料記錄培養(yǎng)期間天氣及氣溫。塑料筒袋寬度1 m，長度15 m。培養(yǎng)液的循環(huán)由水泵（WQD4-5-0.37，博洛尼）驅(qū)動，水泵日間0.5 h開機(jī)1次，每次10 min。每天測定出口處藻液的D(750 nm)、pH值，培養(yǎng)7 d收獲，噴霧干燥后測定質(zhì)量（干物質(zhì)）。

1.8 數(shù)據(jù)處理

每組處理設(shè)置3個平行試驗(yàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)測定D(750 nm)和pH值。用Microsoft Excel和IBM SPSS 21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析，使用鄧肯氏法分析差異顯著性，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對小球藻生長的影響

從外觀顏色變化、光密度及pH三方面調(diào)查溫度對小球藻生長的影響（圖2）。由圖2_a可見，小球藻培養(yǎng)液顏色隨培養(yǎng)時(shí)間延長由淺綠變深綠，低溫（20、25 ℃）下肉眼可區(qū)分的顏色變化發(fā)生較晚，而高溫處理（35、40 ℃）早期顏色變化更為明顯。由圖2_b可見，在培養(yǎng)0～12 h時(shí)，不同溫度下培養(yǎng)的小球藻生長速度有差異，低溫培養(yǎng)（20、25 ℃）下小球藻的D(750 nm)增長低于高溫（35、40 ℃）培養(yǎng)，30、35、40 ℃培養(yǎng)條件下D(750 nm)差別不大，說明較高的溫度適宜小球藻生長。經(jīng)過12 h的黑暗過夜后，各處理的小球藻D(750 nm)基本維持不變，說明呼吸作用消耗并不明顯。24 h后，30 ℃條件下D(750 nm)平均值最高，30 ℃的D(750 nm)平均值為2.481，35 ℃為2.404，25 ℃為2.312。40 ℃為2.170，20 ℃的最低，為1.926?？梢?，該小球藻可適應(yīng)較高的培養(yǎng)溫度，40 ℃高溫對小球藻生長無明顯的負(fù)影響。由pH值也受溫度的影響（圖2_c），總體來看，培養(yǎng)溫度升高可降低pH波動性。

圖2 溫度對小球藻生長的影響Fig.2 Effects of different temperatures on the growth of Chlorella sorokiniana

2.2 光照對小球藻生長的影響

7種照度下小球藻的生長情況見圖3。圖3_a可見，在培養(yǎng)1 d時(shí)，較高照度下（90、45和20 μmol·m-2·s-1）藻液顏色發(fā)生明顯變化，而較低照度下（10、5和2.5 μmol·m-2·s-1）藻液顏色加深程度較小，暗條件下，小球藻顏色幾無變化。由圖3_b可見，在培養(yǎng)1 d時(shí)，各處理組D(750 nm)均升高較為明顯，其提高幅度與照度有相關(guān)性，即照度越高，光密度越高，照度90 μmol·m-2·s-1下的D(750 nm)平均值低于照度45 μmol·m-2·s-1，說明小球藻有光飽和現(xiàn)象。在后續(xù)培養(yǎng)過程中，D(750 nm)持續(xù)增加，從5 d起，照度90 μmol·m-2·s-1下D(750 nm)平均值與45 μmol·m-2·s-1持平，說明在更高細(xì)胞濃度下，光衰減加重，需更高的光照方可滿足小球藻生長對光的需求。在暗條件下，小球藻D(750 nm)基本維持不變?？疾旄魈幚砗透鲿r(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)液的pH值（圖3_c），發(fā)現(xiàn)藻液pH值在培養(yǎng)1 d時(shí)均明顯提升，照度45 μmol·m-2·s-1組pH上升最快，達(dá)到7.99，在后續(xù)培養(yǎng)過程中，藻液pH值基本維持在8.0左右，pH上升可能與小球藻生物量增加相關(guān)，而微藻如何影響pH值是值得探究的問題。

2.3 碳源和氮源對小球藻培養(yǎng)的影響

缺碳和缺氮培養(yǎng)基對小球藻培養(yǎng)結(jié)果見圖4。由表型照片（圖4_a）可見，在TAP培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)1 d時(shí)即可看出明顯的小球藻顏色變化，而在缺碳（TAP-C）、缺氮（TAP-N）和缺碳缺氮（TAP-CN）條件下培養(yǎng)，小球藻顏色幾無變化。圖4_b可見，TAP培養(yǎng)呈現(xiàn)典型的生長曲線，培養(yǎng)1 d時(shí)光密度即明顯上升，D(750 nm)的上升約在3 d達(dá)到峰值，而在其他培養(yǎng)條件下，D(750 nm)的上升均極低，甚至無上升，說明缺碳和缺氮后的培養(yǎng)基不足以滿足小球藻生長的需求。比較幾種缺素培養(yǎng)基可見，缺氮條件下小球藻有一定的生長，可能是由于在其他培養(yǎng)基成分中有少量氮源。缺碳條件下小球藻幾不生長，說明在浮法的半封閉狀態(tài)下直接固定空氣中的二氧化碳對小球藻生長的貢獻(xiàn)不大。

2.4 pH值對小球藻培養(yǎng)的影響

由圖5_a可見，TAP正對照組藻液隨培養(yǎng)時(shí)間的延長顏色加深，水培負(fù)對照組藻液顏色幾無變化。TAP-T（去掉Tris）處理藻液顏色加深，但與TAP組相比，顏色略淺，TAP-T+pH處理組（去掉Tris后）用醋酸調(diào)整pH的藻液顏色會逐步加深。

圖3 照度對小球藻生長的影響Fig.3 Effects of light intensity on the growth of Chlorella sorokiniana

圖4 培養(yǎng)基中碳源和氮源對小球藻生長的影響Fig.4 Effects of carbon and nitrogen source on the growth of Chlorella sorokiniana

圖5 不同pH處理對小球藻生長的影響Fig.5 Effects of different pH treatment on the growth of Chlorella sorokiniana

圖5_b可見，TAP對照組D(750 nm)呈典型的生長曲線，藻液D(750 nm)可達(dá)3.625左右，水培負(fù)對照組小球藻幾無生長。TAP-T處理的小球藻的生長速率略低于正對照，最終D(750 nm)為2.997。TAP-T+pH在培養(yǎng)2 d后D(750 nm)超過正對照TAP組，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長穩(wěn)定增長，最終D(750 nm)為6.347。與圖5_a結(jié)果一致。說明適宜的pH對微藻生長有明顯促進(jìn)作用。圖5_c可見，水培負(fù)對照 組pH在培養(yǎng)1 d 時(shí)陡升，pH由7.26上升到10.61，之后在10.50上下浮動。TAP對照的pH在初期也有升高，之后在8.5上下浮動。TAP-T處理的pH在培養(yǎng)初期快速提升，甚至超過水培處理，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長pH穩(wěn)定在11.70上下。這是因?yàn)門AP培養(yǎng)基中的碳源是乙酸，乙酸的存在讓培養(yǎng)基pH值降低，隨著小球藻的生長和乙酸的消耗，培養(yǎng)基pH值會升高，TAP培養(yǎng)基中含有Tris堿，對pH有一定緩沖作用。TAP-T+pH處理組pH呈波浪式的折線，這是因?yàn)槊刻烊訙ypH后用乙酸調(diào)pH值至7.5左右，之后藻液pH則隨著小球藻的生長重返高位。

2.5 戶外900 L培養(yǎng)體系的建立及初步試驗(yàn)

戶外900 L培養(yǎng)（圖6）期間可觀察到微藻顏色加深。起始D(750 nm)為0.686，經(jīng)7 d培養(yǎng)，最終D(750 nm)為5.335，每天D(750 nm)增加約0.7，取部分藻液，經(jīng)噴霧干燥，收獲藻粉生物量（干物質(zhì)）為0.15 g/(L·d)。下一步將優(yōu)化戶外培養(yǎng)體系，降低環(huán)境因素造成的不利影響，不斷提高產(chǎn)量。

3 討論

傳統(tǒng)的以跑道池為代表的戶外微藻培養(yǎng)體系易受環(huán)境因素干擾，生物學(xué)產(chǎn)量低，對自然資源的利用率低。為進(jìn)一步降低微藻培養(yǎng)成本并減少環(huán)境因子干擾，本研究設(shè)計(jì)一種新的戶外培養(yǎng)體系，并 以小球藻（C.sorokiniana）為材料，調(diào)查在該體系下進(jìn)行小球藻培養(yǎng)的主要影響因子。

圖6 戶外900 L規(guī)模浮法培養(yǎng)試驗(yàn)Fig.6 Outdoor 900 L scale culture using FOS system

3.1 浮法培養(yǎng)體系的特點(diǎn)

與傳統(tǒng)的微藻戶外培養(yǎng)方法相比，浮法培養(yǎng)體系以農(nóng)用塑料筒袋為主要原料，該體系投入低，受光面積增加，對光的利用率提高。浮法可在鹽堿地、荒地甚至沙漠土地搭建，也可在屋頂、水面鋪設(shè)，可臨時(shí)搭建，隨時(shí)拆除，場地恢復(fù)成本低。浮法培養(yǎng)體系相對封閉，藻液受環(huán)境的影響小，液體的蒸發(fā)少。整個培養(yǎng)體系易于操作，技術(shù)門檻低，普通人員稍加培訓(xùn)即可掌握。浮法培養(yǎng)體系的主要缺點(diǎn)是占地面積較大，不適合在造價(jià)高的場地應(yīng)用。

3.2 環(huán)境因子對微藻培養(yǎng)的影響

微藻的戶外培養(yǎng)主要受到溫度、光照等環(huán)境因子的影響。本研究表明，在20～40 ℃溫度范圍內(nèi)小球藻均可生長，在30～40 ℃時(shí)生長速率較高。一般地，微藻最適生長溫度為25 ℃左右，本研究的小球藻可在40 ℃下存活并生長，可見這是耐高溫藻種。本研究的浮法戶外培養(yǎng)試驗(yàn)中，藻液溫度會因戶外陽光照射而明顯提升，有時(shí)較氣溫提高15 ℃左右，所以篩選耐高溫藻種對浮法體系有重要意義。下一步可通過不同藻種的比較及誘變處理，篩選更耐高溫的藻種，便于在夏季戶外培養(yǎng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在浮法培養(yǎng)過程中，試驗(yàn)小球藻表現(xiàn)有光飽和現(xiàn)象，Metsoviti等[23]報(bào)道，普通小球藻（Chlorella vulgaris）在照度 130～520 μmol·m-2·s-1范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的光飽和，也有文獻(xiàn)報(bào)道小球藻（Chlorellasp.）的最適照度為42、90 μmol·m-2·s-1，微擬球藻的最適照度在 100 μmol·m-2·s-1左右，新綠球藻的最適照度在 60 μmol·m-2·s-1左右[24]，可見不同藻種對光照的反應(yīng)不同。但微藻培養(yǎng)的適宜照度均低于夏季中午陽光直射照度，所以在夏季戶外培養(yǎng)過程中，可減少陽光直射的時(shí)間或強(qiáng)度。另外，光照周期及波長也是戶外培養(yǎng)微藻過程中的重要參數(shù)，今后可試驗(yàn)不同波長的光對小球藻生長的影響。

3.3 戶外微藻培養(yǎng)的成本分析

戶外微藻培養(yǎng)需支付的成本包括設(shè)施、動力、土地、人工和消耗材料等。與跑道池和管道式光反應(yīng)器相比，浮法培養(yǎng)的設(shè)施成本低，除農(nóng)用塑料筒袋外，一般只需簡單的管道聯(lián)通即可。浮法養(yǎng)殖微藻可不占用耕地，尤其適合在鹽堿地開展，土地占用成本低。此外，城市污水、養(yǎng)殖污水中含有大量的氮、磷等微藻生長所需的營養(yǎng)元素，從降低成本和環(huán)保角度考慮，這些污水均可用于微藻培養(yǎng)[25]，浮法養(yǎng)藻提供了一個可大面積應(yīng)用的方法。

3.4 戶外培養(yǎng)小球藻的生物學(xué)產(chǎn)量分析

微藻的生物學(xué)產(chǎn)量與培養(yǎng)條件密切相關(guān)，用發(fā)酵罐培養(yǎng)小球藻的生物學(xué)產(chǎn)量可達(dá)24.2 g/(L·d)[26]以上，戶外跑道池培養(yǎng)小球藻的生物學(xué)產(chǎn)量一般在0.1 g/(L·d)左右[27]。本研究借助浮法培養(yǎng)技術(shù)，初步實(shí)現(xiàn)0.15 g/(L·d)的產(chǎn)量，在產(chǎn)量方面還有較大的提升空間。小球藻的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于糧食作物，如進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高單位面積產(chǎn)量，進(jìn)而大面積推廣，則有望為社會做出更大貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

本研究初步建立一種新的微藻平面開放淺層培養(yǎng)體系，稱為“浮法”。該體系有成本低、光利用率高、不易受外界環(huán)境干擾等優(yōu)點(diǎn)，有推廣的潛力。以小球藻為模式，在浮法培養(yǎng)體系下溫度、照度、pH值及培養(yǎng)基營養(yǎng)成分等對培養(yǎng)效果均有影響。在河北保定秋季開展了900 L規(guī)模的戶外培養(yǎng)試驗(yàn)，生物學(xué)產(chǎn)量（干物質(zhì)）為0.15 g/(L·d)。