石磊，楊俊紅，康利改，羅夢圓，左鵬鵬，鞏啟濤

（中低溫?zé)崮芨咝Ю媒逃恐攸c實驗室，天津大學(xué)機械工程學(xué)院，天津 300072）

曝氣間隔對普通小球藻生物質(zhì)積累的影響

石磊，楊俊紅，康利改，羅夢圓，左鵬鵬，鞏啟濤

（中低溫?zé)崮芨咝Ю媒逃恐攸c實驗室，天津大學(xué)機械工程學(xué)院，天津 300072）

細胞高密度培養(yǎng)有利于降低微藻規(guī)?；囵B(yǎng)成本及其生物柴油制造的成本，曝氣是影響微藻規(guī)?；呙芏扰囵B(yǎng)的重要因素之一。以普通小球藻（Chlorella vulgaris，F(xiàn)ACHB-1227）為研究對象，采用BG11培養(yǎng)基，于新型套管式沿程曝氣光生物反應(yīng)系統(tǒng)中，以細胞密度為檢測指標，實驗研究了曝氣間隔時間對藻液中細胞密度、藻液pH值、溶氧量變化的影響?？刂泼看纹貧鈺r氣體流量為10L/min、持續(xù)時間為0.5h，培養(yǎng)周期為15天。結(jié)果表明，藻液中積累的溶解氧能夠及時排除，進入生物質(zhì)積累穩(wěn)定期時，藻液的pH值基本恒定；微藻生長穩(wěn)定期時（培養(yǎng)12天），曝氣間隔0.5h時細胞密度為7.22×106個/mL，相比于1h、1.5h、2h分別提高了9.56%、41.02%和122.1%。可見，適當(dāng)減少曝氣間隔時間，可顯著提高藻細胞密度。

微藻培養(yǎng)；普通小球藻；曝氣間隔；細胞密度；新型套管式光生物反應(yīng)器

微藻可以通過光合作用在其細胞內(nèi)快速產(chǎn)生和積累油脂，被認為是生產(chǎn)生物柴油的最有潛力的原料[1]。相比于其他植物或生物體，微藻在相同的土地面積上能夠生產(chǎn)更多的生物柴油[2-3]。細胞高密度培養(yǎng)有利于降低微藻規(guī)?；囵B(yǎng)成本及其生物柴油制造的成本，然而，在現(xiàn)階段培養(yǎng)微藻的光生物反應(yīng)器中，微藻的生物質(zhì)產(chǎn)量偏低導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高，成為制約微藻商業(yè)化生產(chǎn)的一個瓶頸[4-5]。研制高效大規(guī)模培養(yǎng)微藻光生物反應(yīng)器成為微藻培養(yǎng)的發(fā)展趨勢[6-7]。現(xiàn)階段光生物反應(yīng)器的不同種類中，管式光生物反應(yīng)器是最適于大規(guī)模高密度培養(yǎng)微藻的光生物反應(yīng)器形式[8]。通過對比典型的光生物反應(yīng)器，借鑒了不同種類光生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，作者課題組設(shè)計了新型微藻培養(yǎng)系統(tǒng)，系統(tǒng)中光生物反應(yīng)器是具有高單位光照面積的套管式沿程曝氣光生物反應(yīng)器[9-10]。

曝氣是影響微藻規(guī)模化高密度培養(yǎng)的重要因素之一。在此新型的光生物反應(yīng)器中，由于曝氣間隔時間對微藻的混合程度和光暗循環(huán)周期影響有直接影響，從而影響了微藻的光合作用和對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效果，同時曝氣間隔時間決定著微藻系統(tǒng)運行效果和動力費用。本工作研究了新型光生物反應(yīng)器中了不同曝氣間隔時間對藻液中細胞密度、藻液pH值、溶氧量變化的影響，對微藻擴大規(guī)模培養(yǎng)具有一定指導(dǎo)意義。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

SX-500高壓滅菌器，TOMY DIGITAL BIOLOGY CO. LTD；SW-CJ-2G雙人超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-25數(shù)顯pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；ADAMO溶氧儀，天津市愛德儀器儀表系統(tǒng)科技有限公司；RH-BASIC2磁力攪拌器，德國IKA；BT600-2J蠕動泵，天津市愛德儀器儀表系統(tǒng)科技有限公司；TD-20空氣泵，天津市愛德儀器儀表系統(tǒng)科技有限公司。

1.2 實驗裝置

本實驗中用到的實驗系統(tǒng)裝置見圖1。

在圖1的實驗裝置中，用蠕動泵作為藻液循環(huán)動力，蠕動泵把藻液從密閉的儲液槽中泵到光生物反應(yīng)器中，此時儲液槽由于藻液的減少氣體壓力降低，從而吸引光生物反應(yīng)器中的藻液到儲液槽中完成液體循環(huán)?？諌簷C（為氣體循環(huán)提供動力）吸入的空氣[11]通過氣室和流量計到達光生物反應(yīng)器，然后從光生物反應(yīng)器排出到背壓室（隔絕管路氣體與空氣接觸，防止污染），最后排放到大氣中。

在圖1的實驗裝置中，儲液槽中安裝有pH計、溶氧儀和磁力攪拌器，通過儲液槽中的pH計和溶氧儀這兩個部件可以測量藻液的pH值和溶氧值，磁力攪拌器用來攪拌微藻溶液促進藻液中的微藻細胞混合均勻，防止密閉的儲液槽內(nèi)微藻沉淀。

實驗用的光生物反應(yīng)器是套管式內(nèi)置沿程曝氣光生物反應(yīng)器。具體結(jié)構(gòu)見圖2，該新型光生物反應(yīng)器的外管直徑為200mm，長度為1000mm，壁厚為5mm，在外管上端有一個直徑為30mm的排氣孔，外管材料是硅玻璃，內(nèi)管的材料是有機玻璃，內(nèi)管直徑為100mm，長度為1000mm。在內(nèi)管上有49個均勻分布直徑為1mm的曝氣孔，培養(yǎng)過程中曝氣孔向下與豎直方向夾角為45°。微藻藻液充入到外管和內(nèi)管之間的空間，藻液培養(yǎng)體積達到裝液量的7/8為宜。如果藻液過多，曝氣時藻液可能通過外管上面的排氣口溢出，造成曝氣管路的堵塞，甚至溢出到背壓室，導(dǎo)致氣路壓強過高；如果過少，一方面達不到擴大規(guī)模培養(yǎng)的目的，另一方面藻液不能夠圍繞內(nèi)管流動阻礙了藻液的混合和藻液中溶解氧的排出。

1.3 藻種和培養(yǎng)條件

普通小球藻（Chlorella vulgaris，F(xiàn)ACHB-1227）購置于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫（FACHB-Collection）。普通小球藻在裝有BG11培養(yǎng)基的36L的套管式沿程曝氣光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。

圖2 套管式沿程曝氣光生物反應(yīng)器

按BG11培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分配置36L培養(yǎng)基[12]，并且調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為7.4，把配置好的培養(yǎng)基分別倒入1L的瓶子中，然后放入高壓滅菌器中121℃下滅菌20min。滅菌后，開啟雙人超凈工作臺的紫外燈20min，然后將培養(yǎng)基移入到雙人超凈工作臺中，待培養(yǎng)基溶液冷卻至室溫，準備接種。

微藻培養(yǎng)系統(tǒng)接種過程：首先，用血球計數(shù)板計數(shù)法測出普通小球藻藻種的細胞密度，根據(jù)式（1）計算出接種所需要的藻液體積。

式中，ρ代表微藻培養(yǎng)系統(tǒng)中預(yù)接種的細胞密度；V代表微藻培養(yǎng)系統(tǒng)預(yù)接種的藻液體積；ρ0代表錐形瓶中普通小球藻藻種的細胞密度；V0代表接種時需要的普通小球藻藻種的體積。

開始接種，打開蠕動泵和磁力攪拌器，接種普通小球藻，接種密度是3×105個/mL。藻液循環(huán)速率為1.5L/min。開啟空氣泵，每次曝氣時流量為10L/min、持續(xù)時間為0.5h，培養(yǎng)溫度設(shè)定25℃，光強設(shè)4000 lux，光暗周期12/12h。在以上培養(yǎng)條件下，設(shè)定4種曝氣間隔，分別為0.5h、1h、1.5h和2h。每天8：30開始曝氣并開啟光源，晚上20：30關(guān)閉光源，培養(yǎng)15天。

每天早上9：00和晚上18：00用血球計數(shù)板計數(shù)法測量光生物反應(yīng)器中普通小球藻的細胞密度，并記錄小球藻藻液的pH值和溶氧值。

2 結(jié)果與討論

曝氣間隔對微藻的混合程度和光暗循環(huán)周期影響有直接影響，從而影響了微藻的光合作用效果和生長。不同的曝氣間隔對微藻細胞密度、藻液pH值和溶氧量都有影響。

2.1 曝氣間隔對普通小球藻細胞密度的影響

不同曝氣間隔對普通小球藻細胞密度的影響，如圖3所示。在培養(yǎng)的前3天不同曝氣間隔的微藻密度基本相同，普通小球藻處于生長適應(yīng)期，如圖3中Ⅰ所示。隨后的5～12天普通小球藻生長處于快速生長期，如圖3中Ⅱ所示。直到13天以后小球藻細胞密度增長緩慢，進入了穩(wěn)定期，如圖3中Ⅲ所示。12天時普通小球藻的細胞密度見圖4，結(jié)果表明，曝氣間隔0.5h時的細胞密度為7.22×106個/mL，相比于1h、1.5h、2h分別提高了9.56%、41.02%和122.1%?？梢?，隨著曝氣間隔時間的減少，普通小球藻細胞密度逐漸增大；適當(dāng)減少曝氣間隔時間，可顯著提高藻細胞密度。

圖3 曝氣間隔對普通小球藻細胞密度的影響

圖4 12天時普通小球藻的細胞密度

2.2 曝氣間隔對藻液pH值的影響

普通小球藻的生長代謝對藻液的pH值產(chǎn)生一定的影響，在不同間隔時間下藻液中的pH值變化如圖5所示。由圖3和圖5中可以看出，在培養(yǎng)期前兩天，普通小球藻處于適應(yīng)期，藻液的pH值基本保持不變，如圖5中的Ⅰ所示。在第3天時，小球藻適應(yīng)期結(jié)束，藻液pH值開始急劇變化，曝氣間隔時間為0.5h、1h和1.5h的藻液pH值增加了0.5左右。如圖3和圖5中所示Ⅱ部分，在小球藻進入生長期，隨著細胞密度的增加，藻液的pH值逐漸變大[13]，間隔時間為0.5h、1h、1.5h和2h的藻液pH值分別由7.62、8.15、7.97、8.27增加到8.75、9.13、9.1、9.32。在普通小球藻生長進入穩(wěn)定期以后，藻液pH值停止增加，甚至呈現(xiàn)一定的下降趨勢，圖5中Ⅲ所示。

圖5 不同曝氣間隔下藻液pH變化

2.3 曝氣間隔對藻液溶氧量的影響

套管式沿程曝氣光生物反應(yīng)器的曝氣和排氣方式能夠及時排除藻液中積累的溶解氧。由圖6可見，在培養(yǎng)期前兩天，普通小球藻處于生長適應(yīng)期，藻液的溶氧量基本保持不變。第3天開始，小球藻適應(yīng)期結(jié)束，藻液溶氧量開始出現(xiàn)明顯波動。曝氣間隔2h的藻液溶氧量變化幅度小，并呈現(xiàn)一個下降的趨勢。曝氣間隔1h的藻液溶氧量變化相比于其它間隔時間的溶氧量變化波動幅度較大，主要是受小球藻生長代謝的影響。雖然曝氣間隔0.5h的普通小球藻細胞密度與1h的相差不大，小球藻生長代謝同樣也影響藻液的溶氧量，但是曝氣間隔0.5h的間隔時間相對較短，造成溶氧量的變化幅度相對較小。第11～14天，不同曝氣間隔的溶氧量趨于一個穩(wěn)定的范圍，在6.0～7.0mg/L，大部分在6.5mg/L上下波動；由圖3可知，在第14～15天普通小球藻處于生長穩(wěn)定期，藻液的溶氧量由6.5變?yōu)?.3左右。

當(dāng)藻液中的溶解氧濃度高于7.5mg/L時，微藻的光合作用會受到抑制[14-15]，在培養(yǎng)過程中，套管式沿程曝氣光生物反應(yīng)器曝氣均勻，如圖7所示。新型光生物反應(yīng)器能夠及時排除藻液中的溶解氧，溶氧量一直維持較低的水平（＜7.0mg/L），有利于普通小球藻生物質(zhì)積累。

圖6 不同間隔時間下藻液中溶氧量變化

圖7 套管式沿程曝氣光生物反應(yīng)器均勻曝氣圖

3 結(jié) 論

通過對不同曝氣間隔時間對藻液中細胞密度、藻液pH值、溶氧量變化影響的研究，可以得出以下結(jié)論。

（1）進入穩(wěn)定期時（12天）曝氣間隔0.5h時的細胞密度為7.22×106個/mL，相比于1h、1.5h、2h分別提高了9.56%、41.02%和122.1%?？梢?，隨著曝氣間隔的減少，普通小球藻細胞密度逐漸增大；適當(dāng)減少曝氣間隔，可顯著提高藻細胞密度。

（2）普通小球藻的生長代謝對藻液的pH值產(chǎn)生一定的影響，普通小球藻處于適應(yīng)期，藻液的pH值基本保持不變。在小球藻進入生長期以后，隨著細胞密度的增加，藻液的pH值逐漸變大。在普通小球藻生長進入穩(wěn)定期以后，藻pH值基本恒定，甚至呈現(xiàn)一定的下降趨勢。

（3）套管式沿程曝氣光生物反應(yīng)器的曝氣和排氣方式能夠及時排除藻液中積累的溶解氧，有利于普通小球藻生物質(zhì)積累。

本工作對套管式沿程曝氣光生物反應(yīng)器的參數(shù)優(yōu)化有一定的指導(dǎo)意義，為微藻的擴大規(guī)模培養(yǎng)提供理論支持。

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Effects of different aeration intervals on biomass accumulation of Chlorella vulgaris

SHI Lei，YANG Junhong，KANG Ligai，LUO Mengyuan，ZUO Pengpeng，GONG Qitao
（Key Laboratory of Efficient Utilization of Low and Medium Grade Energy，MOE，School of Mechanical Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

High-density cell culture could reduce the cost of large-scale cultivation of microalgae for biodiesel. Aeration is one of the important factors in high-density culture of microalgae.Chlorella vulgariswas cultured for 15 days in a novel concentric-tube photobioreactor with BG11 medium. The effect of different aeration intervals on cell density ofChlorella vulgaris，pH and dissolved oxygen changes of medium was studied. Air was passed into the concentric-tube photobioreactor at aeration flow rate 10L/min for 0.5h each aeration. The aeration manner of the novel concentric-tube photobioreactor could exclude dissolved oxygen timely. When biomass accumulation was stable，the pH of culture medium was substantially constant；the cell density was 7.22×106cells/mL at aeration interval 0.5h. Compared to the cell concentration at aeration interval 1h，1.5h，2h，the cell concentrations at aeration interval 0.5h increased by 9.56%，41.02%，122.1%，respectively. Therefore，with the decrease of aeration interval time，concentration ofChlorella vulgarisincreased.

microalgae cultivation；Chlorella vulgaris；aeration interval；cell density；novel concentric-tube photobioreactor

TK 6；Q 819

A

1000-6613（2014）10-2735-05

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.10.035

2014-01-13；修改稿日期：2014-01-22。

天津市自然科學(xué)基金項目（13JCYBJC19000）。

石磊（1987—），男，碩士研究生。E-mail shilei245@163.com。聯(lián)系人：楊俊紅，博士，副教授，從事生物熱物理及相關(guān)技術(shù)研究。E-mail yangjunhong@tju.edu.cn。