潘展硯 吳 瓊 王嵐琦 胡婷婷 鞠 強

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院皮膚科，上海，200127

皮膚癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率遠高于肺癌、肝癌等內(nèi)臟腫瘤[1]。皮膚鱗狀細胞癌發(fā)病率較高，容易轉(zhuǎn)移，對患者的生命帶來巨大的威脅。尋找與皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能基因，給對cSCC的早期診斷和精準治療有重要意義[2]。核糖體合成調(diào)控因子1(RRS1)參與rRNA的加工及核糖體生物合成。研究顯示，RRS1基因在許多人類腫瘤中過表達，如宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌、肝癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[3-6]。但是RRS1在皮膚腫瘤上的相關(guān)研究未有報道。本研究通過對臨床標本的免疫組織化學(xué)研究RRS1在cSCC的表達，RRS1基因敲低的方法研究其對人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集2014年9月至2019年6月來自上海交通大學(xué)附屬仁濟醫(yī)院皮膚科和整形外科手術(shù)存檔蠟塊，其中正常皮膚15例，cSCC 15例。以上標本均經(jīng)病理檢查證實，且所有病例手術(shù)前均未經(jīng)化療、放療及其他免疫治療。正常對照組，男8例，女7例，年齡59～85歲，平均(70.00±8.09)歲；cSCC組，男8例，女7例，年齡67～88歲，平均(71.87±8.35)歲。cSCC組與對照組的年齡及性別等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

1.2 材料和試劑 兔抗人RRS1抗體購自美國abcam公司(ab188161)，GADPH抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒(鼠/兔)、粉劑型檸檬酸抗原修復(fù)液、粉劑型 PBS磷酸鹽緩沖液購自福建邁新公司。人鱗狀細胞癌細胞系 SCL-1(中國科學(xué)院上海細胞庫)。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液(美國HyClone公司)，胎牛血清(中國山東博康公司)，青鏈霉素混合液(中國北京索萊寶公司)，轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、Trizol Reagent(美國Invitrogen公司)，RRS1干擾慢病毒、GV115質(zhì)粒(中國上海吉凱公司)，Matrigen基質(zhì)膠(美國BD公司)，Transwell小室(美國Millipore公司)，RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判斷 將所有標本以4 μm厚度連續(xù)切片，將組織切片常規(guī)脫蠟。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，用試劑公司提供的已知陽性切片作為陽性對照。所有標本用檸檬酸修復(fù)抗原。滴加一抗，37℃孵育60 min；PBS 緩沖液沖洗3 min×3次，滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次，滴加新鮮配制的DAB顯色，鏡下控制顯色時間，及時終止顯色; 依次蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，風(fēng)干，樹脂封片。結(jié)果判斷：RRS1以腫瘤細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。采用雙育法，每例均隨機觀察5個高倍視野(×400)，以顯色強度和陽性細胞百分率作為評價標準。采用半定量法判斷結(jié)果:陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分，>75%為4分;陽性強度:無染色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽性細胞數(shù)分和陽性強度分相乘,0分為(-),1～4分為(+),5～8分為(++),9～12分為(+++)。

1.4 慢病毒的構(gòu)建 從NCBI中獲取RRS1基因的全部序列，由上海吉凱公司合成熒光標記的慢病毒，選擇編號為GV115的質(zhì)粒載體。設(shè)計多個RNA干擾靶點序列，經(jīng)過評估測定后，選用RRS1干擾靶點序列為：GCTGCCTTCATTGAGTTTA。熒光標記的慢病毒感染細胞，檢測病毒感染SCL-1細胞的滴度。

1.5 細胞培養(yǎng)及處理 使用含有10%胎牛血清和0.01%青鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) SCL-1細胞。傳代后，在6孔板中培養(yǎng) SCL-1細胞，當匯合率到70%左右時，加入病毒，確保病毒感染效率在80%左右。SCL-1細胞感染慢病毒空載體為Mock組，感染慢病毒shRNA-RRS1為shRNA組。

1.6 QRT-PCR檢測 使用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從細胞中提取總RNA。RNA濃度通過NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA)測定。根據(jù)制造商的規(guī)程，使用First-Strand cDNA Synthesis試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)對20～100 ng RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。在LightCycler 480系統(tǒng)(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)上進行qRT-PCR，并用于分析mRNA的表達水平。使用GAPDH作為內(nèi)部對照，計算基因的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR的引物序列

1.7 Western blotting實驗 收集各組細胞，每組加入200 μL 的裂解液，置于冰上充分裂解 30 min，收集細胞裂解液，12000 rpm、4℃條件下離心12 min，收集上清液。BCA法檢測上清液中總蛋白濃度，每孔上樣40 μg進行電泳分離，恒壓70 V，電泳3 h。然后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，將印跡膜放入對應(yīng)的一抗溶液(稀釋比1∶1000) 中，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，再把條帶放入盛二抗(稀釋比1∶1500) 的平皿中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入4 mL的ECL顯影液顯色3 min，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.8 MTT法檢測細胞增殖 shRNA-Mock組、shRNA組細胞。將細胞接種于96孔培養(yǎng)板，細胞數(shù)為1×105/mL。培養(yǎng)8～12 h細胞長至單層后，并加入5 mg/mL的MTT 10 μL，5% CO2孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜100 μL，常溫下，搖勻10 min，酶標儀測490 nm波長下的吸光度A值，表示細胞活性，兩組均設(shè)6個實驗孔，實驗重復(fù)3次。

1.9 Celigo劃痕實驗分析RRS1基因?qū)CL-1細胞遷移能力的影響 SCL-1細胞細胞轉(zhuǎn)染慢病毒48 h后，待組細胞生長至對數(shù)生長期，鋪96孔板，用劃痕儀在培養(yǎng)皿刮擦細胞以產(chǎn)生劃痕區(qū)域，并用無血清培養(yǎng)基徹底沖洗以除去所有細胞碎片。然后在96孔板中加入培養(yǎng)基。使用Celigo細胞儀(美國Nexcelom公司)拍攝并檢測細胞熒光。Celigo細胞儀自動計算遷移面積，遷移率為遷移細胞面積(9 h)/劃痕面積(0 h)×100%，實驗重復(fù)3次。

1.10 Transwell實驗分析RRS1基因?qū)CL-1細胞侵襲能力的影響 Matrigen基質(zhì)膠包被Transwell小室基底膜。SCL-1細胞細胞轉(zhuǎn)染慢病毒48 h后，待組細胞生長至對數(shù)生長期，將細胞種于24孔板并且置于Transwell小室中，上室加入0.1 mL無血清培養(yǎng)基，下室加入0.5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，觀察細胞遷移情況。取出Transwell小室用PBS洗2次，甲醛固定，用吸水紙吸去上室培養(yǎng)基，滴結(jié)晶紫在小室下表面進行染色，5 min后，沖洗結(jié)晶紫，空氣晾干后顯微鏡下進行拍照(×100)，實驗重復(fù)3次。

1.11 GEO腫瘤數(shù)據(jù)庫分析RRS1在cSCC中的表達 GEO腫瘤表達數(shù)據(jù)庫含有一項正常皮膚(6例)和皮膚鱗狀細胞癌(5例)表達譜數(shù)據(jù)(GDS2200)，可查得RRS1在各樣本中mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 RRS1在cSCC和正常皮膚中的表達 GEO腫瘤表達數(shù)據(jù)庫(GDS2200)顯示RRS1在cSCC組相對表達均值為3342.36±1312.33，在正常皮膚組為1458.55±504.02，P<0.01。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示RRS1在正常皮膚、cSCC中表達于細胞核。圖1示RRS1在cSCC表達顯著高于正常皮膚(P<0.01)(表2)。

表2 RRS1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖1 1a:正常皮膚RRS1主要表達在皮膚細胞核中，表達評分為+(免疫組化，×200);1b:cSCC皮損RRS1主要表達在腫瘤細胞核中，表達評分為+++(免疫組化，×200)

2.2 RRS1對SCL-1細胞增殖的影響 QRT-PCR檢測結(jié)果顯示感染慢病毒后，RRS1的敲減效率達到74%。Western blot結(jié)果證實RRS1被成功敲減(圖2)。細胞鋪于96孔板。MTT連續(xù)檢測5天，發(fā)現(xiàn)shRNA組相比shRNA-Mock組的細胞增殖速率受到顯著抑制。圖2提示RRS1基因與SCL-1細胞的增殖能力顯著相關(guān)。

2.3 RRS1對SCL-1細胞增殖的轉(zhuǎn)移和侵襲性的影響 劃痕實驗結(jié)果表明，shRNA組細胞遷移率為(45.79±1.10)%，Mock組細胞遷移率為(64.56±3.33)%，P<0.01。shRNA組細胞遷移率與Mock組細胞相比明顯降低。Transwell結(jié)果表明，shRNA組侵襲細胞數(shù)為105±2.51，Mock組175±5.41，P<0.01。shRNA組細胞侵襲能力與Mock組細胞相比明顯降低(圖2)。

2a:QRT-PCR檢測結(jié)果顯示感染慢病毒后，RRS1的敲減效率達到74%。Western blot結(jié)果證實RRS1被成功敲減;2b:MTT連續(xù)檢測5天，發(fā)現(xiàn)shRNA組相比Mock組的細胞增殖速率受到顯著抑制;2c:兩組細胞Transwell實驗24小時拍攝的顯微鏡照片(×100);2d:兩組細胞在0小時和9小時，Celigo細胞儀拍攝并檢測細胞熒光照片(×100);2e:Transwell結(jié)果表明，shRNA組侵襲細胞數(shù)為105±2.51，Mock組175±5.41;2f:劃痕實驗結(jié)果表明，shRNA組細胞遷移率為(45.79±1.10)%，Mock組細胞遷移率為(64.56±3.33)%。**與Mock組相比P<0. 01

2.4 RRS1對增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)基因表達的影響 QRT-PCR檢測結(jié)果顯示，增殖相關(guān)基因FGF2，AREG，cyclin E1在shRNA組顯著降低，P<0.01。轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)基因VIM、CXCL1、CXCL3、CXCL8、MMP1在shRNA組顯著降低，P<0.01(表3)。

表3 RRS1敲低后細胞相關(guān)基因表達變化

3 討論

核糖體合成調(diào)節(jié)因子1(RRS1)是由203個氨基酸組成的核蛋白，對于核糖體合成至關(guān)重要，它可以根據(jù)細胞狀態(tài)調(diào)節(jié)核糖體合成速度，然后維持細胞穩(wěn)態(tài)。RRS1的異常表達對核糖體的合成有負面影響，導(dǎo)致核糖體的生理功能異常[7]。一些研究顯示惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與RRS1的異常表達密切相關(guān)。Song等[8]使用RNA干擾技術(shù)來降低RRS1基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)細胞分裂時間明顯延長，表明乳腺癌細胞中RRS1基因的表達水平與細胞增殖有關(guān)。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中與RRS1基因表達水平顯著高于癌旁組織，且RRS1基因與肝癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。最近的研究表明，RRS1在結(jié)腸癌中過表達，并且與腫瘤增殖有關(guān)[6]。有研究顯示，在細胞和動物模型上，長非編碼RNA可以通過抑制RRS1的表達從而抑制乳腺癌的形成和進展[9]。MicroRNA-598也可以通過下調(diào)RRS1的表達來抑制胃癌細胞的生長[10]。因此認為RRS1基因是腫瘤治療中的新的潛在靶標。

RRS1在皮膚腫瘤中的研究還未見相關(guān)報道。本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，RRS1在人正常表皮和cSCC皮損中均有表達，顯示RRS1在皮膚細胞中有生理學(xué)功能。RRS1在cSCC皮損中的表達高于正常皮膚，GEO的表達數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)也證實了這個結(jié)果，提示RRS1的高表達與cSCC的發(fā)病高度相關(guān)。我們用皮膚鱗癌SCL-1細胞進一步探索了RRS1的功能作用，結(jié)果顯示慢病毒敲低RRS1后，SCL-1細胞的增殖活性、轉(zhuǎn)移和侵襲能力均大幅度降低。這些結(jié)果均提示RRS1在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。降低腫瘤細胞內(nèi)RRS1的表達，可能成為防治cSCC的新策略。

我們初步探索了RRS1的作用機制。結(jié)果顯示RRS1敲低后，腫瘤增殖相關(guān)基因FGF2、AREG、cyclin E1表達降低。FGF2和AREG是癌基因，與腫瘤細胞的增殖密切相關(guān)，也是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]。Cyclin E1是細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其過量表達可使CDK2持續(xù)激活，從而使細胞異常增殖導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。RRS1敲低后，轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)基因VIM，MMP1、CXCL1、CXCL3、CXCL8表達也顯著增高。VIM(波動蛋白)表達增高與腫瘤的局部轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12，13]。多個基因芯片研究顯示MMP-1是cSCC疾病的關(guān)鍵基因，可以預(yù)測疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后[14]。CXCL1、CXCL3、CXCL8是趨化因子家族成員，與cSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。RRS1敲低后這些基因表達的改變，解釋了其對腫瘤細胞增殖活性、轉(zhuǎn)移和侵襲能力作用的機制。

綜上所述，RRS1在cSCC中表達明顯增高。RRS1可調(diào)控腫瘤細胞增殖活性、轉(zhuǎn)移和侵襲能力。RRS1表達影響了腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的相關(guān)基因。進一步研究需要明確RRS1與cSCC分期和疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，明確RRS1具體作用機制，明確調(diào)控RRS1表達的因素。使RRS1成為cSCC新的生物學(xué)標志和治療靶點。