馬盼盼 張 釧 王 興 劉芙蓉 郝勝菊 張慶華 陳 雪 周秉博 孫慶梅

甘肅省婦幼保健院，甘肅蘭州，730050

I型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type1, NF1, OMIM: 162200)是一種常見的常染色體顯性遺傳病[1]。該病發(fā)生于兒童早期，幾乎所有的患者都會身體多處出現(xiàn)咖啡色斑，這些色斑隨著患者年齡的增長而增多增大。腋下和腹股溝的色斑出現(xiàn)兒童晚期。大部分成年患者會發(fā)生皮膚神經(jīng)纖維瘤，一般是發(fā)生于皮膚上或稍下部的良性腫瘤[2]。手術(shù)切除叢狀神經(jīng)纖維瘤效果不佳，對于惡性外周神經(jīng)鞘腫瘤可進(jìn)行手術(shù)切除。除此之外，其臨床表現(xiàn)還有骨骼異常、Lisch結(jié)節(jié)、學(xué)習(xí)障礙等。其發(fā)病率約為1∶4000至1∶3000，其中約50%是自發(fā)突變，成人外顯率接近100%[3，4]。

I型神經(jīng)纖維瘤病是由腫瘤抑制基因NF1突變所致。NF1基因位于常染色體17q11.2，由61個外顯子組成[5]。NF1基因的表達(dá)產(chǎn)物為神經(jīng)纖維蛋白。作為“腫瘤抑制因子”，神經(jīng)纖維蛋白通過激活Ras-GTPase而發(fā)揮作用，它的表達(dá)受損使Ras活性持續(xù)增加，可導(dǎo)致細(xì)胞增殖[6]。除了調(diào)節(jié)Ras活性外，神經(jīng)纖維蛋白還可以正向調(diào)節(jié)環(huán)狀單磷酸腺苷(cAMP)的水平。與Knudson的“兩次打擊”假說一致，NF1基因突變的患者會出現(xiàn)一系列I型神經(jīng)纖維瘤病癥狀，例如咖啡斑、神經(jīng)纖維瘤、脛骨發(fā)育異常和視神經(jīng)通路腫瘤[7]。

劉芷兮等[8]總結(jié)了NF1 的突變類型及其基因與表型關(guān)系。NF1 基因突變包括無義突變、錯義突變、基因大片段缺失與剪切突變和移碼突變等，這些突變類型我國均已有相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究對3例散發(fā)患者進(jìn)行基因檢測，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 3例患者均來自甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心。患者1，女，6歲，出生后不久右上肢出現(xiàn)水腫，右胸部腫大，軀干部有多個牛奶咖啡斑，并逐漸增多增大。查體可見軀干部皮膚較多咖啡斑，右胸部有明顯腫物(圖1)，近半年頭暈癥狀加重。患者父母均正常，無家族史?；颊?，女，18歲，6歲時腋窩、腹部、大腿內(nèi)側(cè)逐漸出現(xiàn)密集小牛奶咖啡斑。同時伴腎動脈血管狹窄、繼發(fā)性高血壓。查體見皮膚多處色素沉著(牛奶咖啡斑)，腋窩、腹部、腹股溝有雀斑。患者母親自幼眼瞼、左側(cè)肘部外側(cè)有較小的色斑；患者兄長及父親均未見顯著皮膚色素沉著，無家族史。患者3，女，6歲，全身皮膚可見較大咖啡斑，同時伴有生長激素缺乏性矮小癥(110 cm，血清生長激素0.27 ng/mL)?；颊吒改妇?，無家族史。

1.2 標(biāo)本采集 患者1和患者3分別抽取患者及其父母外周血各2～3 mL，患者2抽取患者、患者父母及其兄長外周血各2～3 mL，所有標(biāo)本均收集于5 mL EDTA抗凝管中，于-80℃保存。3例患者及其家屬均簽署基因檢測知情同意書。

1.3 基因組DNA提取 取200 μL標(biāo)本，采用全自動核酸提取儀提取所有標(biāo)本DNA，然后使用核酸濃度測定儀NanoDrop2000進(jìn)行標(biāo)本DNA濃度測定。所有標(biāo)本DNA濃度在50 ng/μL左右，OD260/280在1.8～2.0之間。

1.4 NF1、NF2基因高通量測序及生物信息學(xué)分析 樣本送檢至邁基諾基因檢測公司進(jìn)行高通量測序，平均測序深度為1000×，所有區(qū)域達(dá)到20×以上的覆蓋度。

1.5 Sanger及MLPA法驗證 點突變驗證分析：根據(jù)NF1基因序列(NM_000267)，使用在線Primer 3.0(http://primer3.ut.ee)軟件設(shè)計引物。對候選致病突變位點所在基因組區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用BigDye測序反應(yīng)試劑盒(美國Applied Biosysterms公司)進(jìn)行測序反應(yīng)，采用ABI 3500D Genetic Analyzer儀器(美國Applied Biosysterms公司)進(jìn)行檢測。測序結(jié)果與NF1基因參考序列(NM_000267)進(jìn)行序列比對。

外顯子雜合缺失分析：采用多重探針連接擴(kuò)增技術(shù) (multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)檢測試劑盒(SALSA MLPA P081及P082探針，荷蘭MRC公司)，實驗經(jīng)過DNA的變性、探針雜交、連接反應(yīng)、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析可檢測NF1基因拷貝數(shù)的變化。

1.6 親緣關(guān)系鑒定 使用中德美聯(lián)親子鑒定套裝1(Expressmarker 22)試劑盒對患者及其父母親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定分析。按照試劑盒說明書完成患者及其父母DNA樣本PCR擴(kuò)增。之后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI 3500D Genetic Analyzer測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。應(yīng)用GeneMapper軟件進(jìn)行電泳結(jié)果分析。

2 結(jié)果

3例散發(fā)I型神經(jīng)纖維瘤病患者中，共檢出NF1基因3個突變(表1)。包括2個雜合缺失和1個無義突變，分布于NF1基因的各個功能區(qū)，無明顯的分布熱區(qū)。我們通過親子鑒定分析3例患者與其父母均符合親緣關(guān)系，Sanger測序和MLPA驗證結(jié)果顯示3例患者父母均不攜帶這些突變，說明3例患者所檢測到的突變均為自發(fā)突變，見表1。

表1 3例患者突變結(jié)果圖

3例患者中患者1為NF1基因整體雜合缺失突變，HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫已有文獻(xiàn)報道與NF1相關(guān)，且為致病性突變[9]；用MLPA法進(jìn)行家系驗證分析，其父母該基因均無缺失，此變異為自發(fā)突變，見圖2?；颊?分析到NF1基因有1個雜合突變c.4064delC，該變異為無義突變，導(dǎo)致氨基酸改變p.S1355X(即1355位的絲氨酸發(fā)生終止突變)，可能導(dǎo)致基因功能喪失；此外經(jīng)家系驗證分析，患者之父母及兄長均未檢測到該位點變異(圖3)，此變異為自發(fā)突變；該變異在正常人群數(shù)據(jù)庫中的頻率未見統(tǒng)計，為低頻變異；根據(jù)ACMG指南，此變異初步判定為致病性變異(Pathogenic)。HGMD數(shù)據(jù)庫未有該位點的相關(guān)性報道；生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件SIFT(https://sift.bii.a-star.edu.sg/www/SIFT4G_vcf_submit.html)、PolyPhen_2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、MutationTaster (http://www.mutationtaster.org)、GERP++(http://mendel.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp/index.html)分別預(yù)測為未知、未知、未知、未知?；颊?檢測到NF1基因14-36號外顯子雜合缺失，HGMD數(shù)據(jù)庫未有該位點的相關(guān)性報道；用MLPA法進(jìn)行家系驗證分析，其父母該基因均無缺失，此變異為自發(fā)突變，見圖4。

圖1 患者1側(cè)面(1a)和正面(1b),軀干部皮膚較多咖啡斑，右胸部有明顯腫物 圖2 患者1家系突變結(jié)果圖 A為患者1患者 NF1基因整體雜合缺失；B、C分別為患者之父、之母NF1基因未見相應(yīng)缺失

圖3 患者2家系突變結(jié)果圖 A為患者2患者NF1基因c.4064delC；圖B、C、D分別為患者之兄、之父、之母未見相應(yīng)位點變異 圖4 患者3家系突變結(jié)果圖 A為患者3患者NF1基因14-36號外顯子雜合缺失；圖B、C分別為患者之父、之母NF1基因14-36號外顯子未見缺失

3 討論

NF1的診斷主要依據(jù)1988年美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)制定的I型神經(jīng)纖維瘤病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。該病典型的臨床特征是：出現(xiàn)于腋窩、腹股溝或全身的皮膚色素沉著-牛奶咖啡斑、多個離散的良性腫瘤-皮膚神經(jīng)纖維瘤和虹膜中的Lisch結(jié)節(jié)。I型神經(jīng)纖維瘤病是一種由NF1基因突變引起的常染色體顯性遺傳病。NF1能夠影響包括腦和脊髓在內(nèi)的所有神經(jīng)。彌散性神經(jīng)纖維瘤多為良性，但其增長能夠侵入周圍組織從而影響其功能或者引起患者容貌缺陷。叢狀神經(jīng)纖維瘤易發(fā)展成惡性外周神經(jīng)鞘瘤(或神經(jīng)纖維肉瘤)。另外一種可能的惡性腫瘤是嗜鉻細(xì)胞瘤。早期進(jìn)行性退化，學(xué)習(xí)困難和認(rèn)知障礙導(dǎo)致這些患者嚴(yán)重的社會障礙[11]。NF1的臨床表型是進(jìn)行性的，甚至在一個家族中也可能有所不同[12]。Zhang等[13]對100個有NF1臨床特征的家系進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)89%具有NF1基因突變，而符合NIH診斷標(biāo)準(zhǔn)的NF1患者中，93%發(fā)現(xiàn)NF1基因突變。本文中3例患者均有不同程度的牛奶咖啡斑，患者1右胸有明顯的腫物，患者2腋窩、腹部、腹股溝有雀斑，3例患者均檢測到NF1基因的突變?；颊?只有較大的咖啡斑，沒有其它表型，可能是因為其年齡尚小，未完全表現(xiàn)出其它表型。

據(jù)統(tǒng)計NF1基因的自發(fā)突變率為50%[2]，Nemethova等[9]對86例I型神經(jīng)纖維瘤病患者家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)78例患者存在NF1基因的突變，其中68個患者存在NF1基因小的突變，39個為新發(fā)突變，自發(fā)突變率為50%，移碼突變占42.3%，無義突變占14.1%，錯義突變占12.8%，剪接突變占11.5%。Yao等[14]對95個I型神經(jīng)纖維瘤病家系進(jìn)行高通量測序及Sanger測序進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)77.9%為自發(fā)突變。Zhu等[15]應(yīng)用DNA測序、MLPA及cDNA測序等技術(shù)對32個符合NIH診斷標(biāo)準(zhǔn)的I型神經(jīng)纖維瘤病患者進(jìn)行NF1基因突變檢測。發(fā)現(xiàn)30例(93.8%)患者存在NF1基因突變，包括10個(33.3%)移碼突變，4個(13.3%)錯義突變，6個(20.0%)無義突變和2個(6.7%)剪接位點突變。此外還發(fā)現(xiàn)了8個(26.7%)涉及一個以上外顯子的缺失突變。郎小喬等[16]對三例散發(fā)I型神經(jīng)纖維瘤病患者進(jìn)行NF1基因檢測，發(fā)現(xiàn)三種新發(fā)突變，分別為39號外顯子堿基G缺失(c.5635 del G)，47號外顯子大片段堿基缺失(c.7041～7062+4 del)，21號外顯子堿基A、C缺失(c.2714-2715 del AC)。

NF1突變譜包括錯義/無義(27.7%)、剪接(16.3%)、微缺失(26.9%)、微插入(11.1%)、總?cè)笔?>20 bp;13.3%)、總插入(>20bp;2.0%)和復(fù)雜重排(0.6%)等[8]。本文中3例I型神經(jīng)纖維瘤病患者均檢測到NF1基因突變，且均為自發(fā)突變，其中2例為外顯子缺失突變，1例為無義突變，與現(xiàn)有報道的突變率相差較大，可能是因為我們收集的樣本量過少所致。也可能是在甘肅地區(qū)缺失突變是常見的變異類型，是由于地域性差異造成的，這有待于繼續(xù)收集病例進(jìn)一步驗證。

總之，我們通過對來自甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心的3例I型神經(jīng)纖維瘤病患者進(jìn)行高通量測序，將檢測出的變異在先證者及其父母中進(jìn)行MLPA以及一代測序驗證，發(fā)現(xiàn)2個新發(fā)突變位點，豐富了NF1基因突變譜。