李欣蒙 高洪蓮 劉奇奇 于睿 張磊

近視是最常見的屈光不正，近年來逐漸出現低齡化、高度近視增加的趨勢。有研究表明，近視是全球的第二大致盲病因[1]。高度近視患者除遠視力較差外，還可發(fā)生不同程度的眼底改變；與正常人相比，發(fā)生視網膜脫離、裂孔及黃斑出血的危險性更大[2]。

目前，臨床上近視治療最常應用的藥物是低濃度阿托品[3-4]，但作為非選擇性M型受體阻斷劑，長期使用會出現畏光、視物模糊、過敏性結膜炎等不良反應[5]，且其具體作用機制及可能發(fā)生的遠期副作用尚不明確。有研究表明，近視主要是由眼軸增長引起的，鞏膜細胞外基質(ECM)的重塑在近視眼軸增長的過程中發(fā)揮重要作用。龍琴等[6]研究發(fā)現，近視的發(fā)生伴有基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)表達升高，后部鞏膜膠原降解增加，進而導致鞏膜變薄。有研究指出，轉化生長因子β1(TGF-β1)通過調節(jié)膠原產生和成纖維細胞增生、刺激鞏膜成纖維細胞和軟骨細胞增生參與鞏膜的重塑[7]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是肌成纖維細胞特征性表達的細胞骨架蛋白，也是肌成纖維細胞最主要的收縮結構，在組織纖維化、傷口愈合、瘢痕形成中均起著重要的作用[8]。這些因子均參與了近視的眼軸增長導致后極部鞏膜變薄的過程。有研究表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路參與了近視的發(fā)生發(fā)展[9]，雷帕霉素是mTOR信號通路的特異性抑制劑[10]，且雷帕霉素可以調節(jié)角膜[11]、肝臟[12]、腎臟[13-14]等組織中MMP-2、TGF-β1及α-SMA因子的表達。本實驗旨在觀察雷帕霉素球結膜下注射對豚鼠形覺剝奪性近視(FDM)的形成是否有干預作用，以及對鞏膜組織中MMP-2、TGF-β1及α-SMA等因子表達的影響，研究其可能的作用機制和對視網膜結構的影響，以期為臨床上抑制近視的發(fā)展尋找新的藥物治療方向提供一定的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物2～3周齡健康斷乳花色豚鼠80只(山東省濟南市西嶺角生物科里有限公司)，雌雄不限，體質量為200～250 g，采用手持裂隙燈、檢眼鏡排除眼瞼、眼底異常的豚鼠；行屈光及眼軸檢查，排除先天性高度近視的豚鼠，于濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學實驗室動物房飼養(yǎng)，采用日光燈予以照明，明暗周期12 h/12 h，喂養(yǎng)環(huán)境維持在22～28 ℃、濕度50%，自由攝食、進水。本實驗遵守濱州醫(yī)學院動物管理委員會的動物福利倫理要求，給予人道主義關懷。

1.1.2 主要試劑及儀器雷帕霉素(HY-10219，Med Chem Express公司)；糖原過碘酸-雪夫(PAS)染色試劑盒(北京索萊寶)；動物組織總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(羅氏公司)；AKT兔多克隆抗體、p-AKT-S473小鼠單克隆抗體、mTOR兔多克隆抗體、p-mTOR-Ser2448兔多克隆抗體、GAPDH小鼠單克隆抗體、酶標親和純化山羊抗小鼠IgG(H+L)、酶標親和純化山羊抗兔IgG(H+L)均購自Proteintech中國公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(北京碧云天生物科技有限公司)；5×蛋白上樣緩沖液(大連美侖公司)；熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理80只豚鼠采用隨機數字表法分為4組，每組20只?？瞻讓φ战M：雙眼不進行任何干預；FDM組：為保證豚鼠正常覓食，左眼不做干預，5-0線縫合右眼眼瞼；雷帕霉素組：分別于實驗第1天、第7天兩次右眼球結膜下注射雷帕霉素50 μg；FDM+雷帕霉素組：分別于實驗第 1天、第7天兩次右眼球結膜下注射雷帕霉素50 μg后再縫合右眼眼瞼。實驗組(FDM組、雷帕霉素組、FDM+雷帕霉素組)豚鼠術后給予右眼眼瞼換藥、涂氧氟沙星眼膏預防感染。

1.2.2 雷帕霉素試劑的配制及豚鼠注藥量雷帕霉素溶于DMSO，配制成母液，在無菌操作下用雙蒸水稀釋，使終濃度為1 g·L-1，按照豚鼠每眼50 μg行球結膜下注射。

1.2.3 豚鼠眼生物學測量指標分別于實驗前及實驗第7天、第14天測量各組豚鼠的眼軸長度和屈光度。眼軸長度測量采用A型超聲波(法國光太公司)，測量前使用鹽酸丙美卡因滴眼液行表面麻醉，由同一位經驗豐富的專業(yè)技師進行，連續(xù)驗光5次，取其平均值。使用手持帶光檢影鏡(重慶康華瑞明科技股份有限公司)進行屈光度測量，測量前使用復方托吡卡胺滴眼液進行豚鼠右眼散瞳，共3次，間隔15 min，由同一位經驗豐富的專業(yè)技師進行操作，使用帶狀光檢影驗光，連續(xù)驗光5次，取其平均值。

1.2.4 標本收集空白對照組隨機選取4只豚鼠、實驗組實驗第7天、第14天各隨機選取2只豚鼠，進行PAS染色和視網膜透射電鏡觀察；空白對照組隨機選取6只豚鼠，實驗組實驗第7天、第14天各隨機選取3只豚鼠，使用頸椎脫臼法處死豚鼠后，摘出右眼眼球，于冰塊上快速取后極部鞏膜，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.5 PAS染色觀察各組豚鼠視網膜形態(tài)100 g·L-1水合氯醛腹腔過量注射麻醉處死各組豚鼠后取出眼球，保留2 mm視神經，生理鹽水沖洗干凈后置于冰上去除結膜、筋膜、眼外肌等組織，浸泡于Davidson 固定液固定3 h。沿視神經方向切開眼球，剔除晶狀體、玻璃體等眼球內容物，切面朝下放入包埋盒，梯度脫水至蠟后包埋組織。切片厚4 μm，選取靠近視盤的切片進行PAS染色、透明、封片后在光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 透射電鏡下觀察各組豚鼠視網膜形態(tài)100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉各組豚鼠后，灌注固定至右心房流出的液體顏色變?yōu)榈t色時更換體積分數3%戊二醛溶液，至豚鼠四肢及頸部明顯僵硬、眼球壁微凹時摘取眼球，用注射器針頭在角膜上刺幾個孔，進一步固定眼球。沿赤道部環(huán)切，保留帶有視網膜的后半部眼球(避開黃斑部)，將組織切成 1～2 mm長條，體積分數3%戊二醛固定液、10 g·L-1四氧化鋨后固定、酒精丙酮梯度脫水、包埋劑浸透過夜后定向包埋，半薄切片鈾染、鉛染后透射電鏡下觀察各組豚鼠視網膜形態(tài)。

1.2.7 RT-PCR檢測各組豚鼠鞏膜中mTOR、MMP-2、TGF-β1、α-SMA的mRNA表達按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組豚鼠鞏膜總RNA，紫外分光光度計測量提取的RNA濃度；進行反轉錄，合成cDNA；以cDNA為模版進行PCR擴增，引物以β-actin為內參，根據NCBI中所提供的mTOR、MMP-2、TGF-β1、α-SMA序列，由Takara合成引物序列。按2×SYBR Green qPCR Mix說明書設置PCR反應條件，記錄Ct值，使用2-△△Ct法進行分析。RT-PCR反應引物序列如下：mTOR上游引物為5’-TTCCGCCTTCACAGATACCC-3’，下游引物為5’-CCTCACAGCCACAGAAAGCA-3’，大小為8621 bp；MMP-2上游引物為5’-TGATAACCTGGATGCCGTTG-3’，下游引物為5’-TGCTTCCAAACTTCACGCTCT-3’，大小為3093 bp；TGF-β1上游引物為5’-TACCCCAGAGTGGTTGTCCTTT-3’，下游引物為5’-ACCGATCCCGTTGATTTCC-3’，大小為1597 bp；α-SMA上游引物為5’-CCCAGAAGAGCATCCAACC-3’，下游引物為5’-ACCGCCTGAATAGCCACATAC-3’，大小為2006 bp；β-actin上游引物為5’-GCTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’，下游引物為5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’，大小為1746 bp。

1.2.8 Western blot檢測各組豚鼠鞏膜中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的蛋白表達取各組豚鼠鞏膜置于冰上研磨，加入裂解液裂解15 min，轉移至EP管，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸15 min；電泳、轉膜后，70 g·L-1脫脂奶粉中封閉3 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST沖洗3次×10 min，加入二抗室溫孵育2 h，TBST沖洗3次×10 min，化學發(fā)光法(ECL)顯影，Image Lab軟件分析各組豚鼠鞏膜中各因子蛋白表達的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法本研究使用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件分析，實驗結果以均數±標準差表示，采用多組間單因素方差分析，兩組間均數采用LSD-t檢驗分析。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 各組豚鼠眼生物學指標比較實驗開始前80只豚鼠右眼均呈遠視狀態(tài)，4組豚鼠間右眼眼軸長度、屈光度差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。實驗第7天、第14天，FDM組豚鼠眼軸長度和屈光度均大于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；雷帕霉素組與空白對照組相比，豚鼠眼軸長度和屈光度差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。實驗第7天，FDM+雷帕霉素組與FDM組相比，豚鼠眼軸長度和屈光度差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.081、0.062)；實驗第14天，FDM+雷帕霉素組豚鼠眼軸長度和屈光度均小于FDM組，且差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表1)。

2.2 各組豚鼠視網膜形態(tài)比較

2.2.1 PAS染色觀察各組豚鼠視網膜形態(tài)各組豚鼠PAS染色后光學顯微鏡下觀察發(fā)現(見圖1)，空白對照組、雷帕霉素組豚鼠視網膜各層結構清晰，染色均勻，內、外界膜明顯，外核層厚，細胞質較少，核小而密集，藍色深染，內核層細胞較外核層薄，細胞多層排列稍稀疏，細胞核大著色較深；節(jié)細胞體積較大，單層排列，細胞體圓形或錐形，細胞質豐富，核大淺染。實驗第7天，FDM組與空白對照組相比，視網膜較薄，外核層稍變薄，細胞體變小，排列稍紊亂，內核層細胞層數及數量減少，節(jié)細胞數量減少；FDM+雷帕霉素組與空白對照組相比，外核層細胞排列稍紊亂，外叢狀層染色變淺。實驗第14天，FDM組視網膜各層形態(tài)學改變更加明顯，視網膜各層厚度明顯變薄，內外叢狀層及神經纖維層染色淺，內外核層細胞排列紊亂、稀疏，細胞層數明顯減少，節(jié)細胞可見脫失，殘留細胞多數體積變小，核固縮，細胞質染色變淺，可見空泡。FDM+雷帕霉素組實驗第14天較第7天時視網膜形態(tài)未見明顯改變。

表1 各組豚鼠不同時間點右眼眼軸長度、屈光度比較

圖1 不同時間點各組豚鼠視網膜PAS染色結果 A:空白對照組；B:雷帕霉素組實驗第7天；C:雷帕霉素組實驗第14天；D:FDM組實驗第7天；E:FDM組實驗第14天；F:FDM+雷帕霉素組實驗第7天；G:FDM+雷帕霉素組實驗第14天。

2.2.2 透射電鏡觀察各組豚鼠視網膜形態(tài)各組豚鼠視網膜透射電鏡下觀察發(fā)現(見圖2)，空白對照組、雷帕霉素組實驗第7天和第14天，視網膜結構正常，各層結構排列緊密。實驗第7天，FDM組視錐、視桿細胞膜盤間隙不均、輕度水腫，部分脫落、變短；內叢狀層和外叢狀層輕微水腫；內核層細胞和節(jié)細胞胞質水腫，少量空泡樣改變。實驗第14天，FDM組各層結構間隙增大，可見細胞水腫、胞質空泡樣改變。實驗第7天、第14天，FDM+雷帕霉素組各層間結構稍疏松，其余未見明顯異常。

2.3 各組豚鼠鞏膜中不同因子mRNA的表達實驗第7天、第14天，與空白對照組相比，FDM組豚鼠鞏膜中mTOR mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，MMP-2、α-SMA的mRNA相對表達量均增多，TGF-β1 mRNA相對表達量減少，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。雷帕霉素組與空白對照組相比、FDM+雷帕霉素組與FDM組相比，豚鼠鞏膜中mTOR、MMP-2、α-SMA的mRNA相對表達量均減少，TGF-β1 mRNA相對表達量均增多，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表2)。

圖2 不同時間點各組視網膜透射電鏡觀察結果 A:空白對照組；B:雷帕霉素組實驗第7天；C:雷帕霉素組實驗第14天；D:FDM組實驗第7天；E:FDM組實驗第14天；F:FDM+雷帕霉素組實驗第7天；G:FDM+雷帕霉素組實驗第14天。

表2 各組豚鼠鞏膜中不同時間點各因子mRNA相對表達量

2.4 各組豚鼠鞏膜中不同因子蛋白的表達Western blot檢測結果顯示，實驗第7天、第14天，FDM組與空白對照組相比，豚鼠鞏膜中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的蛋白表達量差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；雷帕霉素組與空白對照組相比、FDM+雷帕霉素組與FDM組相比，豚鼠鞏膜中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的蛋白表達量均減少，且差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表3、圖3)。

表3 實驗第7天、第14天各組豚鼠鞏膜中各因子蛋白的相對表達量

圖3 Western blot檢測各組豚鼠鞏膜中不同因子蛋白表達 A：實驗第7天Western blot電泳圖；B：實驗第14天Western blot電泳圖。

3 討論

目前多數研究認為，鞏膜ECM重塑是近視眼軸增長的主要原因。在近視的形成與發(fā)展中，鞏膜的機械特性影響了眼軸的形態(tài)。MMP-2可降解I型膠原纖維，介導鞏膜生物力學強度下降，導致其膠原結構變薄、ECM成分改變，在FDM小鼠模型中，MMP-2 mRNA和蛋白表達均升高[15]。TGF-β1參與調節(jié)纖維母細胞增殖、ECM和膠原纖維的形成。有研究表明，FDM會引起大鼠鞏膜組織中TGF-β1的蛋白和mRNA表達降低[16]、雞視網膜和脈絡膜中TGF-β1活性下降[17]，引起鞏膜主動重塑；高活性的TGF-β1可升高TIMP-2的表達，間接抑制MMP-2的活性，導致鞏膜厚度增加、抑制膠原的降解[18]。α-SMA是肌成纖維細胞特征性表達的細胞骨架蛋白，也是肌成纖維細胞最主要的收縮結構[7]，成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化受到組織應力和TGF-β調控[19]；且α-SMA在近視眼發(fā)育過程中肌成纖維細胞表型的變化與創(chuàng)面愈合過程中發(fā)生的變化不同[20]。以往有研究表明，在小鼠、樹鼩模型中，近視鞏膜細胞中α-SMA表達增加[21-22]。

雷帕霉素是一種大環(huán)內酯類免疫抑制藥物，具有療效好、毒性低、無腎毒性的特點。Lewis鼠結膜下注射雷帕霉素的研究發(fā)現[23]，注射200 μg·kg-1及以下劑量不會引起眼組織結構及視網膜功能的異常，且雷帕霉素對缺氧損傷視網膜神經節(jié)細胞有保護作用[24]。本實驗中豚鼠球結膜下注射50 μg雷帕霉素，結果發(fā)現，對于正常豚鼠視網膜形態(tài)沒有影響，而對FDM豚鼠的視網膜形態(tài)改變有一定的改善作用；應用雷帕霉素后，豚鼠鞏膜組織中MMP-2、α-SMA的mRNA相對表達量減少，TGF-β1 mRNA相對表達量增多，與近視眼軸變長時MMP-2、α-SMA的mRNA相對表達量增多、TGF-β1 mRNA相對表達量減少的變化趨勢相反[6-8]，說明雷帕霉素可以調節(jié)近視相關因子的表達來抑制FDM。雷帕霉素的特異性結合蛋白是哺乳動物mTOR，PI3K/AKT/mTOR是mTOR的經典信號轉導通路[25]，活化的mTOR通過介導下游靶分子來發(fā)揮生物學作用。本實驗中Western blot檢測結果顯示，球結膜下注射雷帕霉素后，雷帕霉素組與空白對照組相比、FDM+雷帕霉素組與FDM組相比，鞏膜組織中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的蛋白表達量均減少，說明可能是通過結合PI3K/AKT/mTOR信號通路發(fā)揮了抑制近視的作用。

本實驗中還發(fā)現，單純縫合豚鼠眼瞼7 d即可誘導出相對近視，雷帕霉素抑制了FDM誘導的近視進展，眼軸延長變慢、屈光度減小，而不改變正常的眼睛發(fā)育；實驗第7天，FDM+雷帕霉素組與FDM組相比，眼軸長度和屈光度差異雖均無統(tǒng)計學意義，但FDM+雷帕霉素組豚鼠眼軸長度及屈光度較FDM組略有減少；實驗第14天，FDM+雷帕霉素組與FDM組相比，豚鼠眼軸長度和屈光度的減少差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，這表明隨著注藥次數的增加及作用時間的延長，雷帕霉素逐漸發(fā)揮作用，能抑制近視的進展，但并不能完全抑制近視。

本實驗周期較短，給藥次數及注藥劑量均存在一定局限性，長期應用是否會產生副作用尚不明確；且未設置近視形成后加用雷帕霉素的組別，明確其是否可以停止或延緩近視的發(fā)展；蛋白水平只是證實了經典的PI3K/AKT/mTOR信號通路，未研究是否與其他近視信號通路存在關聯；雷帕霉素結合mTOR后下游信號的變化機制是否與激活自噬[26]相關，這些還需在此實驗基礎上進一步研究，進而為雷帕霉素應用于臨床近視的治療提供實驗基礎。

致謝：感謝濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床實驗室董洪亮老師在電鏡實驗中給予的幫助！