賴正權(quán)，艾偉鵬，廖慧君，廖祝元，丘金燕，蔡雨峰，楊婷婷，黃裕茵，廖醒環(huán)，蘇子仁

[1.深圳大學(xué)總醫(yī)院藥學(xué)部，深圳 518055；2.華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院(深圳大學(xué)第六附屬醫(yī)院)藥學(xué)部，深圳 518052；3.江西青峰藥業(yè)有限公司，贛州 341000；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣州 510006]

苦木注射液收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第二十冊(cè)，為苦木干燥枝或莖經(jīng)加工制成。其原料苦木[Picrasmaquassioides(D.Don)Benn]為苦木科(Simaroubaceae)苦木屬植物，具有清熱、解毒、消炎的功效，用于感冒、上呼吸道感染、急性扁桃體炎、腸炎、細(xì)菌性痢疾等[1]?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，苦木含有生物堿、苦味素、三萜類和揮發(fā)油類等化學(xué)成分，其中生物堿及苦味素為其主要的藥效成分[2-12]，具有抗菌消炎、解熱降壓、抗腫瘤、抗蛇毒和抗瘧等作用[13-16]。

部頒標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)苦木注射液的質(zhì)量控制方法僅有薄層色譜法及重量法，質(zhì)量控制方法有待提高。有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法單獨(dú)測(cè)定苦木注射液中鐵屎米酮類或咔巴啉類生物堿的含量[17-18]，其標(biāo)準(zhǔn)多側(cè)重于測(cè)定苦木注射液中同類母核結(jié)構(gòu)成分的含量，而同時(shí)測(cè)定多個(gè)母核結(jié)構(gòu)成分的方法尚未見報(bào)道。為確保該品種的質(zhì)量穩(wěn)定、可控，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定苦木注射液中鐵屎米酮類和咔巴啉類共7個(gè)生物堿含量的分析方法，可為該品種質(zhì)量控制體系的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津高效液相色譜儀(SPD-M20A PDA檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AT泵、LC solution色譜工作站，日本島津公司)；試驗(yàn)室專用超純水機(jī)(重慶利迪現(xiàn)代水技術(shù)設(shè)備有限公司)；BSA224S-SW 電子天平(感量：0.1 mg，德國Sartorius公司)；CP225D電子天平(感量：0.01 mg，德國Sartorius公司)。

1.2試藥 對(duì)照品1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉(a)，1-甲酸-β-咔巴啉(b)，1-丙酸基-β-咔巴啉(c)，3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮(d)，3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮(e)，4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮(f)，4，5-二甲氧基-鐵屎米酮(g)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心從苦木[Picrasmaquassioides(D.Don)Benn.]的莖中分離得到，并經(jīng)四大光譜確定結(jié)構(gòu)式，HPLC歸一法測(cè)定純度>98%，可供對(duì)照用，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1?？嗄咀⑸湟河汕喾逅帢I(yè)有限公司提供。甲醇為色譜純(Merck公司)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

圖1 7個(gè)生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的制備 分別取1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5、6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5、6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、4，5-二甲氧基-鐵屎米酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為30，153，22.8，11.4，7.2，12，3 μg·mL-1對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。4 ℃保存、備用。臨用前，用甲醇按照1，2/3，1/2，1/3，1/6和1/30的比例稀釋對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2供試品溶液的制備 取適量苦木注射液，過孔徑0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3色譜條件 色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相30 mmol·L-1乙酸銨(冰乙酸調(diào)pH值4.5)溶液(A)-甲醇(B)梯度洗脫(0～6 min，5%→6% B；6～9 min，6%→20% B；9～30 min，20%→23% B；30～40 min，23%→30% B；40～50 min，30%→36% B；50～75 min，36%→65% B；75～80 min，65%→5% B；80～85 min，5% B)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長254 nm。結(jié)果化合物a、b、c、d、e、f、g均能達(dá)到基線分離，樣品中其他成分對(duì)測(cè)定無干擾，見圖2。

a.1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉；b.1-甲酸-β-咔巴啉；c.1-丙酸基-β-咔巴啉；d.3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮；e.3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮；f.4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮，g.4，5-二甲氧基-鐵屎米酮。

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法分別配制成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1，線性相關(guān)系數(shù)均>0.999 0，表明線性關(guān)系良好。

表1 7個(gè)生物堿的線性回歸方程和線性范圍

2.5精密度試驗(yàn) 取同一份混合對(duì)照品溶液(濃度：1/3倍儲(chǔ)備溶液濃度)，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉，1-甲酸-β-咔巴啉，1-丙酸基-β-咔巴啉，3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮，3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮，4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮峰面積的RSD分別為0.2%，0.3%，0.1%，1.0%，0.9%，0.5%和0.9%。表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)苦木注射液(批號(hào)：181016)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品，在室溫下放置0，4，8，12，24，48 h時(shí)，分別按“2.3”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄各對(duì)照品的峰面積。結(jié)果1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮峰面積的RSD分別為0.5%，0.7%，0.6%，1.2%，1.8%，0.5%和0.3%。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)苦木注射液(批號(hào)：181016)6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.3”項(xiàng)下色譜方法依次進(jìn)樣，分別測(cè)定7個(gè)生物堿的含量。結(jié)果1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮的平均含量分別為19.14，65.02，11.09，4.89，1.83，4.52，2.03 mg·L-1；RSD分別為0.8%，1.3%，0.4%，1.7%，2.1%，0.7%和0.5%。表明測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 量取已測(cè)含量的苦木注射液(批號(hào)：181016)2 500 μL共6份，分別置5 mL量瓶中，準(zhǔn)確加入與樣品中含量等量的對(duì)照品溶液，加甲醇定容至刻度。按“2.2”項(xiàng)下方法同法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮的平均回收率分別為100.19%，100.23%，99.22%，100.51%，101.65%，99.69%，101.17%；RSD分別為1.05%，2.12%，0.91%，2.21%，0.97%，0.82%，1.38%。表明本方法符合分析方法學(xué)要求。

表2 7個(gè)生物堿的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9樣品測(cè)定 取不同批次苦木注射液樣品，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.3”項(xiàng)下色譜方法分別進(jìn)樣，測(cè)定7個(gè)生物堿的峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 苦木注射液中7個(gè)生物堿的含量測(cè)定

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 苦木注射液的主要成分是生物堿類成分，筆者在本實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相系統(tǒng)(A：甲醇-乙酸銨溶液系統(tǒng)；B：甲醇-磷酸鹽緩沖溶液系統(tǒng)；C：甲醇-十二烷基苯磺酸鈉水溶液系統(tǒng)；D：甲醇-氨水系統(tǒng))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以A系統(tǒng)分離度、峰形及理論塔板數(shù)較好。同時(shí)為了優(yōu)化A系統(tǒng)的色譜條件，考察了流動(dòng)相中不同pH值(3.5，4.0，4.5和5.0)、不同乙酸銨濃度(20，25，30，35 mmol·L-1)，最終優(yōu)選了pH值4.5，乙酸銨濃度30 mmol·L-1。

3.2色譜柱的選擇 通過對(duì)比五個(gè)不同品牌的色譜柱：Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC Pack ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters SymmetryShield RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Luna、Gemini色譜柱柱效較好，最后選用pH值適應(yīng)范圍寬的Gemini色譜柱。

3.3指標(biāo)成分的選擇 本研究選擇了7個(gè)生物堿成分作為指標(biāo)，建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定7種生物堿含量的分析方法，經(jīng)系統(tǒng)的方法學(xué)考察，結(jié)果此法重現(xiàn)性好、操作簡便、準(zhǔn)確性高。其中化合物3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮首次被選為指標(biāo)性成分，用于苦木注射液的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.4測(cè)定結(jié)果分析 無質(zhì)量監(jiān)控的同一廠家10批次產(chǎn)品中7個(gè)生物堿含量波動(dòng)較大，7個(gè)生物堿總含量差異也大，提示加強(qiáng)指標(biāo)成分的質(zhì)量監(jiān)控，有利苦木注射液的質(zhì)量穩(wěn)定。產(chǎn)品的質(zhì)量與原料質(zhì)量、生產(chǎn)工藝密切相關(guān)，要提高產(chǎn)品質(zhì)量，不但要監(jiān)控原料的質(zhì)量，而且還要優(yōu)化、穩(wěn)定生產(chǎn)工藝。