孫銘澤，宋遙遙，盧曉霆*

（長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春 130012）

玉米作為主要的糧食作物，一直以來是商品市場上的大品種，玉米深加工產(chǎn)品主要有玉米淀粉、玉米蛋白粉、變性淀粉、玉米淀粉糖、玉米油、食用酒精、谷氨酸、賴氨酸、木糖醇等數(shù)百個品種[1]。微生物油脂也可采用玉米淀粉糖發(fā)酵生產(chǎn)[2]，具有潛在商業(yè)化價值，可應用于營養(yǎng)保健品、藥物、水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料和生物柴油原料等方面[3-8]。但目前國內生產(chǎn)淀粉糖的原料大都采用玉米淀粉，生產(chǎn)成本高，作為發(fā)酵用糖液會造成資源浪費[9]。與復雜的濕法玉米淀粉生產(chǎn)技術相比，玉米粉是將玉米籽粒通過磨碎、篩分、風選等簡單方法，分出胚芽和纖維，而得到低脂肪的玉米粉。玉米粉水解糖液含有葡萄糖、蛋白質、脂肪及多種維生素、礦物質和微量元素等，是發(fā)酵工業(yè)物美價廉的重要原料[10-11]。玉米粉液化、糖化工藝優(yōu)化的方法有雙酶法、復合糖化酶法、噴射液化法、擠壓酶解法等[12-15]，目的是提高液化液質量，為糖化創(chuàng)造有利條件，縮短糖化時間，提高糖液質量，節(jié)約能耗，降低生產(chǎn)成本。

本研究以玉米粉為原料，以葡萄糖當量（dextrose equivalent，DE）值作為評價指標，通過單因素試驗與正交試驗對玉米粉水解糖液液化、糖化工藝條件進行優(yōu)化，旨在為微生物油脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉（水分含量為13.85%，粗淀粉含量為71.10%）：市售；α-淀粉酶（酶活4 000 U/g）：天津市光復精細化工研究所；糖化酶（酶活100 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；無水氯化鈣（分析純）：西隴化工股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；丙三醇、葡萄糖（均為分析純）：北京化工廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市光復科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

BGT-8A糖化儀：杭州博日科技有限公司；GT10-1型高速臺式離心機：北京時代北利離心機有限公司；UV5100B紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；LH-T55數(shù)顯折光儀：杭州陸恒生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米糖液制備工藝流程

1.3.2 分析方法

（1）還原糖的測定

采用DNS法[16]，待測液5 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋至適宜倍數(shù)待測；葡萄糖標準曲線的制備，取配制好的不同含量得標準葡萄糖溶液0.5 mL，再加入3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑1.5 mL，輕搖混勻，沸水浴5 min顯色，冷卻后加4 mL去離子水，振蕩均勻。在波長540 nm處比色，以去離子水為空白，測出各管的吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標，葡萄糖含量（x）為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到回歸方程為y=0.000 7x+0.021 9，相關系數(shù)R2=0.992 1。取適當稀釋后的樣品0.5 mL，按上述方法測吸光度值，按照標準曲線回歸方程計算待測液還原糖含量。

（2）干物質含量的測定

采用折光法[17]測定料液的干物質含量（°Bx）。

（3）葡萄糖當量值

DE值計算公式如下[18]：

1.3.3 玉米粉糖液液化工藝優(yōu)化

液化液的DE值控制一般在15%～20%[19-20]。液化DE值過低，料液易老化、黏度較高、不宜操作，還會將一些液化不完全的大分子糊精帶入糖化過程，直接影響糖化質量；液化程度過高不利于糖化過程酶與底物形成絡合結構，影響催化效率。

單因素試驗：以玉米粉為原料，按料液比分別為1∶8、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2（g∶mL）配制不同濃度的粉漿，pH值為6.2，無水氯化鈣含量0.2%，α-淀粉酶添加量分別為2 U/g、4 U/g、6 U/g、8 U/g、10 U/g玉米粉，液化溫度分別為70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃，液化時間分別為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，酶解結束沸水浴10 min滅酶，5 000 r/min離心取上清液，測定還原糖含量與干物質含量，計算DE值。分別考察料液比、α-淀粉酶添加量、液化溫度及液化時間對玉米粉糖液液化的影響。

正交試驗：根據(jù)單因素試驗所得結果，使用L9（34）正交設計，以DE值為評價指標，進行3因素3水平正交試驗確定最優(yōu)液化工藝條件。

1.3.4 玉米粉糖液糖化工藝優(yōu)化

單因素試驗：液化液調pH值為4.3，糖化溫度分別為50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃，糖化酶添加量分別為50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g、300 U/g，糖化時間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h，糖化液沸水浴10 min滅酶，5 000 r/min離心取上清液，測定還原糖含量與干物質含量，計算DE值。糖化酶添加量、糖化溫度及糖化時間對玉米粉糖液糖化的影響。

正交試驗：根據(jù)單因素試驗所得結果，使用L9（34）正交設計，以DE值為評價指標，進行3因素3水平正交試驗確定最優(yōu)糖化工藝條件。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

本研究測定試驗均重復3次，結果為平均值的方式表示。使用OEA3.1軟件進行正交試驗設計，SAS 9.1進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 玉米粉糖液最佳液化工藝條件的確定

2.1.1 料液比對液化效果的影響

由圖1可知，隨著玉米粉漿中含水量的降低，DE值先逐漸增加后又降低，料液比為1∶4（g∶mL）時DE值最大；料液比過小即料液濃度過低，淀粉水解產(chǎn)物糊精濃度低使酶活力穩(wěn)定性降低[17]，料液中還原糖產(chǎn)生的少，DE值較低；料液比過大即料液濃度過高，理論上可產(chǎn)生較多的糊精對增加酶活力穩(wěn)定性有提高作用，但料液含水量過低，原料玉米粉吸水不充分，流動性較差，黏度較高，不利于酶與底物結合，故產(chǎn)生的還原糖較少，造成料液DE值較低[21-22]。因此，最適料液比為1∶4（g∶mL），此時料液淀粉水解產(chǎn)物糊精濃度可使酶活力穩(wěn)定性增加，同時有利于酶與底物結合，產(chǎn)生短鏈糊精和少量低分子糖類，從而還原糖增加、DE值最大。

圖1 料液比對葡萄糖當量值的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on dextrose equivalent value

2.1.2 液化時間對液化效果的影響

液化開始時首先是α-淀粉酶分解淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵產(chǎn)生糊精和低聚糖，此酶促反應速度較快。但α-淀粉酶不能水解α-1,6糖苷鍵，也不能水解緊靠分支點的α-1,4糖苷鍵，所以水解支鏈淀粉的速度較直鏈淀粉慢。此時酶解產(chǎn)物的積累與α-1,6糖苷鍵相對比例的增大會使得酶促反應速度下降[23]。由圖2可知，液化時間為40 min時，DE值達到一個高點，其原因是最初還原糖含量的增加速度比干物質含量增加的速度要快，但是此時的還原糖含量卻沒有達到最大值。而當液化時間為60 min時，DE值稍有降低，是因為還原糖的含量平穩(wěn)，干物質量略有升高[18]。之后隨著時間增加DE值逐漸升高。考慮液化醪DE值在15%～20%對后序糖化有利，因此，選擇最適液化時間為60 min。

圖2 液化時間對葡萄糖當量值的影響Fig.2 Effect of liquefaction time on dextrose equivalent value

2.1.3α-淀粉酶添加量對液化效果的影響

在酶促反應中，底物濃度足夠高時，酶促反應速度隨著酶添加量的增加而提高。由圖3可知，隨著α-淀粉酶添加量的增大，液化醪DE值逐漸提高。當液化醪液化程度（DE值）控制在15%～20%時，利于后續(xù)糖化與發(fā)酵。α-淀粉酶添加量＞8 U/g時，DE值過高，生成的糊精分子太小，不利于后續(xù)糖化酶構成絡合結構，影響糖化酶的催化效率[24]。因此，最適α-淀粉酶添加量為6 U/g。

圖3 α-淀粉酶添加量對葡萄糖當量值的影響Fig.3 Effect of α-amylase addition on dextrose equivalent value

2.1.4 液化溫度對液化效果的影響

玉米淀粉的糊化溫度是65～75 ℃，糊化過程淀粉顆粒吸水膨脹，晶體結構破壞，有利于液化過程酶與底物作用，淀粉分子形成低分子糊精溶液。由圖4可知，在液化溫度為80 ℃時DE值最高，在溫度高于80 ℃后DE值有所降低。這是因為在一定溫度范圍內，酶促反應速度隨溫度的升高而增快，至最適反應溫度后，繼續(xù)升高溫度會造成部分酶的失活，使反應速度下降[25]。因此，最適液化溫度為80 ℃。

圖4 液化溫度對葡萄糖當量值的影響Fig.4 Effect of liquefaction temperature on dextrose equivalent value

2.1.5 液化條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗所得結果，考察液化時間、α-淀粉酶量、液化溫度3個因素對玉米粉液化程度的影響，選擇合適的水平范圍，以DE值為考察指標，進行正交試驗確定最優(yōu)液化條件。正交試驗結果與分析見表1，方差分析見表2。

表1 玉米粉液化條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for liquefaction conditions optimization of corn flour

表2 玉米粉液化條件優(yōu)化正交試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results for liquefaction conditions optimization of corn flour

由表1可知，液化工藝條件對于液化程度的影響主次順序為A＞B＞C，即液化溫度＞α-淀粉酶量＞液化時間，最優(yōu)液化工藝條件組合為A2B3C2，即液化溫度80 ℃、α-淀粉酶量8 U/g、液化時間60 min。在此最佳液化條件下進行3次平行驗證試驗，液化液DE值為20.6%。

從表2可以看出，液化條件對液化程度的影響均達到了顯著水平（P＜0.05）。因此在玉米粉糖液液化時，液化溫度、α-淀粉酶量和液化時間這3個因素都要考慮。

2.2 玉米粉糖液最佳糖化工藝條件的確定

2.2.1 糖化時間對糖化效果的影響

圖5 糖化時間對葡萄糖當量值的影響Fig.5 Effect of saccharification time on dextrose equivalent value

由圖5可知，糖化時間8 h之前，隨著時間的推移糖化醪的DE值大幅度提高；在糖化時間8～14 h時DE值提高不大，逐漸趨于平緩；糖化時間＞14 h之后，DE值增加不明顯，其原因是糖化酶底物專一性很低，除能從淀粉分子非還原末端切開α-1,4糖苷鍵之外，也能切開α-1,6糖苷鍵和切開α-1,3糖苷鍵，但前者的速度要快于后兩種糖苷鍵；而糖化酶作用于支鏈淀粉時，從非還原末端順次切下葡萄糖單位，遇到α-1,6糖苷鍵分支處，先將α-1,6糖苷鍵切開，再將α-1,4糖苷鍵水解，故水解支鏈淀粉的速度受水解α-1,6糖苷鍵速度的控制[26]。因此，考慮提高設備利用率和節(jié)約時間，選擇最優(yōu)糖化時間為10 h。

2.2.2 糖化酶添加量對糖化效果的影響

圖6 糖化酶添加量對葡萄糖當量值的影響Fig.6 Effect of glucoamylase addition on dextrose equivalent value

糖化醪底物濃度足夠高時，隨著加酶量的增加糖化程度也隨之增加[27]。由圖6可知，隨著糖化酶添加量的增加，糖化醪DE值逐漸增加，當糖化酶加量為200 U/g原料，DE值達到高峰，之后隨著加酶量增加，DE值增加量趨于平衡，這是因為糖化酶添加量低時，漿液中酶沒達到飽和，酶促反應不充分，還原糖產(chǎn)量較低，當酶量達到飽和后，加酶量的增加對反應影響不大，還原糖的增加量變化不明顯，因此，綜合考慮成本和糖化酶解效果，選擇最適加酶量為200 U/g。

2.2.3 糖化溫度對糖化效果的影響

糖化溫度能顯著影響酶促反應，在適宜的溫度范圍內，酶促反應隨著溫度的升高加快，至最適反應溫度時到達最快。若溫度繼續(xù)升高，會導致酶失活，使得酶促反應速度降低[28]。由圖7可知，DE值在糖化溫度低于60 ℃范圍內逐漸升高，但糖化溫度高于65 ℃后糖化酶失活嚴重，DE值降低。因此，選擇最適糖化溫度為60 ℃。

圖7 糖化溫度對葡萄糖當量值的影響Fig.7 Effect of saccharification temperature on dextrose equivalent value

2.2.4 糖化條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗所得結果，以DE值為考察指標，進行正交試驗確定最優(yōu)糖化工藝條件。正交試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 玉米粉糖化條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for saccharification conditions optimization of corn flour

續(xù)表

表4 玉米粉糖化條件優(yōu)化正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results for saccharification conditions optimization of corn flour

由表3可知，糖化工藝條件的主次順序為糖化溫度＞糖化酶添加量＞糖化時間；得到最佳糖化工藝條件組合為A2B3C3，即糖化溫度60 ℃，糖化酶添加量250 U/g，糖化時間12 h。在此優(yōu)化工藝條件下進行3次平行驗證試驗，糖化液DE值為93.1%。由表4可知，糖化酶添加量和糖化時間對結果均有顯著的影響（P＜0.05），糖化溫度對結果有極顯著的影響（P＜0.01）。因此，在玉米粉糖液糖化時，溫度、糖化酶添加量和時間這三個因素都要考慮。

3 結論

通過單因素與正交試驗確定了玉米粉糖液的最佳液化和糖化工藝條件，即最佳液化工藝條件為液化溫度80 ℃、α-淀粉酶添加量為8 U/g、液化時間60 min；最佳糖化條件為糖化溫度60 ℃、糖化酶添加量250 U/g、糖化時間12 h。在此最佳工藝條件下，制備的玉米粉糖液DE值達93.1%，且糖液澄清度高，提高了玉米粉糖液的質量和得率。本研究及結果可為玉米粉糖液雙酶法的工業(yè)化提供理論依據(jù)。