劉夢琦，朱媛媛，倪慧，王玉榮，郭壯

(湖北文理學院,湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽, 441053)

豆渣又名豆腐渣，是豆腐、豆奶和腐竹等生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品[1]。新鮮豆渣含水量高、豆腥味重、口感粗糙、難以貯存且干燥成本高，因而應用率較低，造成了一定的環(huán)境問題和資源浪費[2]。豆渣中含有豐富的膳食纖維、礦物質(zhì)和維生素等成分，可為部分微生物菌株的生長提供必要的營養(yǎng)需求，同時微生物的生長亦可改善豆渣的口感，并在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種活性物質(zhì)和酶系[3]。我國是豆制品的生產(chǎn)和消費大國，因而利用微生物發(fā)酵開發(fā)豆渣產(chǎn)品是極為必要的[4]。

霉豆渣又名豆渣粑，是以豆渣為原料經(jīng)微生物發(fā)酵制作而成的地方特色發(fā)酵食品，在我國湖北省、湖南省和江西省具有一定的分布，其中湖北省主要分布在荊州和洪湖地區(qū)[5]。近年來，國內(nèi)研究人員圍繞霉豆渣微生物多樣性解析開展了系列研究，張燕鵬等[6]對江西省瑞金地區(qū)霉豆渣微生物類群解析發(fā)現(xiàn)，其真菌主要隸屬于串珠霉屬(Monilia)、根霉屬(Rhizopus)和酵母屬(Saccharomyces)，細菌主要隸屬于微球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、片球菌屬(Pediococcus)和異常球菌屬(Deinococcus)。毛欣欣[7]研究發(fā)現(xiàn)湖南省邵陽地區(qū)霉豆渣細菌類群主要為克羅諾桿菌屬(Cronobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和Staphylococcus，真菌類群主要為Rhizopus和絲孢酵母屬(Trichosporon)。由此可見，不同地區(qū)制作的霉豆渣其微生物群落結(jié)構(gòu)可能存在一定的差異，然而目前關于湖北省霉豆渣微生物類群的研究鮮見報道。

作為近年來較為流行的第二代高通量測序技術，Illumina MiSeq測序技術具有成本低、通量高和結(jié)果準確的優(yōu)點，目前廣泛地應用于豆豉[8]、豆瓣醬[9]、醬油[10]和腐乳[11]等發(fā)酵食品的微生物多樣性解析中。本研究采用Illumina MiSeq測序技術對湖北省荊州地區(qū)下轄的監(jiān)利市和石首縣所產(chǎn)霉豆渣真菌多樣性進行了比較分析，明確了2 個縣市所產(chǎn)霉豆渣真菌多樣性的共性及差異，并對造成差異的真菌類群進行了甄別，以期為后續(xù)以霉豆渣為代表的地方特色發(fā)酵豆制品的產(chǎn)業(yè)化推進提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霉豆渣：采集自湖北省荊州地區(qū)下轄的監(jiān)利市容城鎮(zhèn)(E112°35′～113°19′，N29°26′～30°12′)和石首縣高陵鎮(zhèn)(E112°43′～112°47′，N29°67′～29°85′)，2個采樣點間的直線距離約為60 km。

引物SSU0817F/SSU1196R，武漢天一輝遠生物科技有限公司；5×FastPfuBuffer、dNTPs Mix、FastPfuFly DNA Polymerase，寶生物工程大連有限公司；基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

PE300高通量測序平臺，美國Illumina公司；CR21N高速冷凍離心機，日本HITACHI公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司；vetiri梯度基因擴增儀，美國ABI公司；Fluor Chem FC3型化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國ProteinSimple公司；R930機架式服務器，美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

2019年11月于湖北省荊州地區(qū)下轄的監(jiān)利市和石首縣采集農(nóng)家自制的霉豆渣樣品各4份，編號為JL1～JL4和SS1～SS4。樣品采集時，霉豆渣的制作時間在10～15 d，顏色一般為白色不帶有黑色或綠色的斑點，略帶醬臭味但不刺鼻，其制作工藝大體分為清漿、壓榨、蒸料、再次壓榨、攤晾、篩勻、成型和霉制等8 個流程。將采集的樣品放入采樣箱中帶回實驗室進行分裝，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 樣品微生物宏基因組DNA提取、PCR擴增及高通量測序

按DNA提取試劑盒中的步驟進行DNA提取，使用分光光度計進行檢驗，置于-20 ℃暫存?zhèn)溆?。以合格的DNA為模板，SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)和SSU1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)為引物，參照周書楠等[12]的方法對真菌18S rRNA V4～V5區(qū)進行PCR擴增。將合格的擴增產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用PE300高通量測序平臺進行測序。

1.3.3 生物信息學分析

序列下機后，參照郭壯等[13]的方法對序列進行質(zhì)控，剔除錯配的序列并進行篩選得到合格的序列集。利用QIIME分析平臺[14]，對合格的序列進行分析，繼而對序列使用PyNAST軟件[15]進行標準比對和對齊，之后使用2步UCLUST法在100%和97%的相似度下進行劃分[16]，構(gòu)建分類操作單元矩陣(operational taxonomic units，OTU)，最后使用SILVA數(shù)據(jù)庫[17]對真菌 OTU 代表性序列進行同源性比對。在繪制系統(tǒng)發(fā)育樹的基礎上，對樣品的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香濃指數(shù)等α多樣性指標進行分析，然后基于UniFrac距離使用加權(quán)組平均法(weighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚類和主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)對2 個縣市霉豆渣樣品真菌類群進行β多樣性解析。

1.3.4 多元統(tǒng)計分析及圖表繪制

應用多元方差分析(multivariate analysis of variance，MANOVA)對2 個縣市霉豆渣樣品真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性進行分析，使用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)分析對關鍵真菌類群進行甄別。使用R軟件(v4.0.2)的waterfall軟件包繪制瀑布圖，使用Origin 2017繪制其他圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

本研究的8 個霉豆渣樣品經(jīng)質(zhì)控后得到216 309條高質(zhì)量的序列，平均每個樣品27 039條。經(jīng)2步UCLUST劃分后，監(jiān)利市4 個霉豆渣樣品OTU的數(shù)量分別為693、753、807 和770 個，石首縣的分別為838、847、446和368 個。使用折線圖對2 個縣市樣品的α多樣性進行比較分析，進而判斷本研究測序深度是否滿足后續(xù)分析的要求。

由圖1-a可知，當測序量達到近40 000 條時，稀釋曲線尚未進入平臺期，說明隨著測序深度的增加霉豆渣中新的真菌物種會進一步被發(fā)現(xiàn)。由圖1-b可知，當測序量達到5 000 條時，香農(nóng)指數(shù)曲線已經(jīng)進入平臺期，這說明本研究的測序深度已可完全捕獲霉豆渣中真菌類群的生物學信息。由此可見，本研究的測序深度是符合后續(xù)分析要求的。

本研究中樣品的最小測序深度為10 010條序列。在該測序深度下，監(jiān)利市4個霉豆渣樣品的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為390、341、393和391，香濃指數(shù)為3.44、3.10、3.28和3.36；石首縣各樣品的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為357、346、170和348，香濃指數(shù)為2.98、2.75、0.90和2.89。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，采集自監(jiān)利市的霉豆渣真菌類群的香濃指數(shù)顯著偏高(P<0.01)，而兩者發(fā)現(xiàn)物種數(shù)差異不顯著(P>0.05)。由此可見，采集自監(jiān)利市的霉豆渣真菌多樣性要顯著高于石首縣(P<0.01)。

a-稀釋曲線；b-香農(nóng)指數(shù)曲線圖1 稀釋曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線Fig.1 Rarefaction curves and shannon index curves

2.2 基于門和屬分類學地位的真菌類群分析

本研究將平均相對含量>1.00%的真菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢門或?qū)伲瑢⑵渌?1.00%的門或?qū)贇w并為“其他”(others)，將不能鑒定到門或者屬水平的序列歸并為“不可鑒定”(unclassified)?；陂T水平2 個縣市霉豆渣真菌類群的比較分析如圖2所示。

圖2 基于門水平2 個縣市霉豆渣真菌類群的比較分析Fig.2 Comparative analysis of fungal groups of Meitauza from Jianli city and Shishou county at the phylum level

由圖2可知，所有霉豆渣樣品中真菌類群可鑒定為3 個門，分別為子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和毛霉門(Mucoromycota)，平均相對含量分別為57.77%、33.54%和8.00%，有0.69%的序列無法鑒定到門水平。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，采集自2 個縣市的霉豆渣樣品在門水平上真菌類群差異均不顯著(P>0.05)。

本研究中的所有序列可鑒定為32 個真菌屬，其中平均相對含量>1.00%的有5 個，其相對含量如圖3所示。

圖3 基于屬水平2 個縣市霉豆渣真菌類群的比較分析Fig.3 Comparative analysis of fungal groups of Meitauza from Jianli city and Shishou county at the genus level

由圖3可知，5 個平均相對含量>1.00%的真菌屬分別為鐮刀霉屬(Fusarium)、Trichosporon、籃狀菌屬(Talaromyces)、放射毛霉屬(Actinomucor)和枝孢屬(Cladosporium)，平均相對含量分別為34.60%、28.96%、12.51%、7.27%和1.55%。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，2 個縣市霉豆渣中僅Fusarium含量差異非常顯著(P<0.01)，其在監(jiān)利市和石首縣樣品中的平均相對含量分別為56.74%和12.45%。

Fusarium和Trichosporon為監(jiān)利市各樣品中的優(yōu)勢真菌屬，平均相對含量分別為56.74%和17.40%，樣品JL1和JL2中亦存在一定量的Actinomucor，相對含量分別為7.46%和11.02%。采集自石首縣的霉豆渣樣品存在一定的差異性，其中Fusarium和Trichosporon為樣品SS1、SS2和SS4中的優(yōu)勢菌，其平均相對含量分別為16.52%和51.65%，而樣品SS3中優(yōu)勢真菌屬為Talaromyces，相對含量達到88.39%。此外，較之樣品SS2和SS4，樣品SS1中還含有一定量的Actinomucor，相對含量為31.83%。由此可見，采集自石首縣的霉豆渣真菌類群組間差異性可能要大于監(jiān)利市。

研究表明，F(xiàn)usarium和Talaromyces具有一定的致病性，Talaromyces可能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[18]和肺炎[19]等疾病，而Fusarium可能引起皮膚或呼吸道的感染[20]。有研究表明霉豆渣主要依靠毛霉菌進行發(fā)酵，管瑛[21]從湖北省黃石市陽新縣霉豆渣中分離出了隸屬于毛霉科(Mucoraceae)的雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)。本研究發(fā)現(xiàn)Actinomucor僅為部分霉豆渣樣品中的優(yōu)勢真菌屬，其在樣品JL3和SS2中的相對含量均<1.00%，而在樣品SS3中根本不存在。由此可見，霉豆渣樣品的真菌類群整體上是存在較大差異的，究其原因可能在于霉豆渣含水量較高、營養(yǎng)物質(zhì)豐富且制作方式為開放式發(fā)酵，多種真菌均可以其為基質(zhì)進行生長，因而環(huán)境、制作工具及豆渣本身攜帶的微生物直接決定了最終產(chǎn)品中的真菌類群構(gòu)成。由于發(fā)酵環(huán)境的開放性和發(fā)酵條件的不可控，霉豆渣的生產(chǎn)受外界影響較大且存在一定的食用安全隱患，因而在后續(xù)研究中積極分離、鑒定和篩選具有較高食用安全性和優(yōu)良發(fā)酵特性的Actinomucor菌株，并將其用于霉豆渣的生產(chǎn)具有積極的意義。

2.3 基于OTU水平的真菌類群分析

在97%的相似度下，本研究將序列劃分到了3 918 個OTU，若某一OTU在8 個樣品中均存在，則定義其為核心OTU，相對含量如圖4所示。

圖4 基于OTU水平的2 個縣市霉豆渣真菌核心類群Fig.4 Fungal core groups of Meitauza from Jianli city and Shishou county at the OTU level

由圖4可知，核心OTU共有10 個，僅占總OTU數(shù)量的0.26%，但包含的序列數(shù)占總序列的59.56%。OTU1 366被鑒定為Trichosporon，平均相對含量為27.50%；OTU2 599、OTU2 028、OTU1 846、OTU963和OTU1 206被鑒定為Fusarium，其中OTU963的平均相對含量高達29.08%；而其他4 個OTU均鑒定不到屬水平，累計平均含量僅為0.29%。這也進一步證實了，F(xiàn)usarium和Trichosporon為采集自監(jiān)利市和石首縣多數(shù)霉豆渣樣品中的優(yōu)勢真菌類群。

本研究發(fā)現(xiàn)有20 個OTU在監(jiān)利市4 個霉豆渣樣品中均存在，但在石首縣樣品中均不存在，其累計包含序列僅占總序列數(shù)的0.69%，且均鑒定不到屬水平。沒有發(fā)現(xiàn)有OTU僅存在于石首縣4個霉豆渣樣品中，而在監(jiān)利市樣品中不存在。

2.4 β多樣性分析

本研究進一步采用基于UniFrac距離的UPGMA聚類和PCoA對2 個縣市霉豆渣真菌類群的β多樣性進行了分析，結(jié)果如圖5所示。

a-基于聚類分析；b-主坐標分析圖5 基于聚類分析和主坐標分析的2個縣市霉豆渣真菌類群β多樣性分析Fig.5 Analysis of beta diversity of fungal groups in Meitauza from Jianli city and Shishou county using cluster analysis and principal coordinate analysis

由圖5-a可知，監(jiān)利市4個樣品形成一個聚類，石首縣樣品SS2和SS4可單獨形成一個聚類，雖SS1和SS3與該地區(qū)其他2個樣品無法形成一個分支，但2個縣市霉豆渣形成了明顯的聚類趨勢。由圖5-b可知，監(jiān)利市樣品主要分布在第一和第四象限，而石首縣樣品主要分布在第二、三和四象限。由此可見，不同縣市制作的霉豆渣樣品其真菌類群呈現(xiàn)出一定的差異。在提取PCoA前85%因子的基礎上，本研究采用MANOVA分析發(fā)現(xiàn)，2個縣市霉豆渣樣品真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異(P<0.05)。本研究團隊對湖南省湘西土家族苗族自治州龍山縣和湖北省宜昌市當陽市的豆豉[22]及湖北省恩施土家族苗族自治州咸豐縣和湖北省宜昌市當陽市的辣椒醬[23]細菌多樣性進行了解析，亦發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，究其原因可能在于生態(tài)環(huán)境和制作工藝的不同會對發(fā)酵食品微生物類群的形成產(chǎn)生一定影響。大量研究表明，不同地區(qū)特殊發(fā)酵食品中蘊含了較為豐富和獨特的微生物類群，對其進行挖掘、保藏和篩選，對我國特色發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化推進和使用安全性提升均具有積極的意義[24]。

由圖5-a可知，監(jiān)利市樣品JL1和JL2，JL3和JL4兩兩形成一個分支且在樹的末端，這說明4個樣品的真菌類群較為相似；而石首縣樣品SS3和SS1的分支相對較長，這說明這2個樣品真菌類群與其他樣品存在較大差異。由圖5-b可知，較之監(jiān)利市樣品，石首縣樣品空間分布更為分散。由此可見，采集自石首縣的霉豆渣真菌類群組間差異性可能要大于監(jiān)利市，這也進一步驗證了圖3的結(jié)論。本研究進一步對2 個縣市樣品真菌類群的組間差異進行了分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 兩個縣市霉豆渣真菌類群的組間差異性分析Fig.6 Intergroup difference analysis of fungal groups in Meitauza from Jianli city and Shishou county注：*表示兩者差異顯著(P<0.05)

由圖6可知，采集自監(jiān)利市霉豆渣樣品真菌類群的組間距離為0.039±0.002，而石首縣為0.107±0.206，且經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，兩者差異顯著(P<0.05)。由此可見，采集自石首縣的霉豆渣真菌類群組間差異性大于監(jiān)利市。

2.5 關鍵真菌類群甄別

本研究進一步采用LEfSe分析對導致2 個縣市霉豆渣真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異的類群進行了甄別，結(jié)果如圖7所示。

圖7 基于LEfSe分析2 個縣市霉豆渣關鍵真菌類群的甄別Fig.7 Identification of key fungal groups in Meitauza from Jianli city and Shishou county by LEfSe analysis

由圖7可知，導致2 個縣市霉豆渣真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異的類群隸屬于雙足囊菌科(Dipodascaceae)的耐堿酵母屬(Galactomyces)，其在采集自監(jiān)利市樣品中的相對含量為1.46%，而在石首縣樣品中僅為0.62%，為非優(yōu)勢菌屬。值得一提的是，除Galactomyces外并未發(fā)現(xiàn)其他類群導致2個縣市霉豆渣真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。由此可見，正是由于部分相對含量較少的真菌類群存在差異，進而導致了采集自2個縣市的霉豆渣真菌群落結(jié)構(gòu)的不同。

3 結(jié)論

湖北省荊州地區(qū)霉豆渣中的優(yōu)勢真菌類群以Fusarium、Trichosporon、Talaromyces、Actinomucor和Cladosporium為主。雖然荊州地區(qū)下轄的監(jiān)利市和石首縣制作的霉豆渣具有大量的核心真菌類群，但采集自2 個地區(qū)的樣品真菌類群存在顯著的差異，且該差異主要是由Galactomyces等非優(yōu)勢真菌類群導致的。