母 童 虎紅紅 顧亞玲 張 娟

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川750105)

乳腺作為給犢牛提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗體的外分泌腺體，其內(nèi)部匯集有大量具有泌乳功能的腺泡。腺泡周?chē)娜橄偕掀ぜ?xì)胞(mammary epithelial cells,MECs)以單層而緊密的方式排列，它是乳腺中合成和分泌乳汁的基本單元，也是乳腺對(duì)外界病原進(jìn)行免疫保護(hù)的重要組分。乳汁正是在MECs內(nèi)由血液中的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜生化過(guò)程而形成，經(jīng)過(guò)腺泡腔、乳腺導(dǎo)管和乳頭管3個(gè)部位，最后從乳頭排出體外[1]。長(zhǎng)期以來(lái)由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作等方面的需求，體外培養(yǎng)技術(shù)不斷成熟，牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)體外分離培養(yǎng)技術(shù)也得到了迅速發(fā)展和應(yīng)用，在很大程度上解決了活體試驗(yàn)條件不可控、操作困難、周期長(zhǎng)、成本高及個(gè)體差異大等諸多問(wèn)題，還可以為體外研究乳腺組織生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律、泌乳機(jī)制、乳房疾病等提供良好的細(xì)胞模型[2-4]。因此，建立穩(wěn)定的BMECs體外培養(yǎng)技術(shù)具有重要的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值[5]。雖然BMECs的研究已經(jīng)歷半個(gè)多世紀(jì)，但越來(lái)越多的學(xué)者們利用BMECs開(kāi)展的研究方向表現(xiàn)出多元化，體外分離培養(yǎng)的BMECs依然存在很多新的問(wèn)題和缺陷。本文主要從BMECs的分類和作用、培養(yǎng)方法、模式及其在基因表達(dá)機(jī)理研究和組學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述和總結(jié)，以期為BMECs體外分離培養(yǎng)相關(guān)研究提供有價(jià)值的參考和新思路。

1 BMECs的分類和作用

作為泌乳系統(tǒng)專有的腺體組織，乳腺的發(fā)育大多發(fā)生在出生后[6]，實(shí)質(zhì)為高度分枝的樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，以腺泡為功能單位。Capuco等[7]研究表明，在整個(gè)生物體的生殖生命中乳腺經(jīng)歷周期性的重塑，在每個(gè)發(fā)情周期中，尤其是在懷孕期間，上皮細(xì)胞數(shù)量顯著增加，組織中可以檢測(cè)到更多的腺泡，之后乳腺漸漸發(fā)生退縮，重新恢復(fù)至剛開(kāi)始的穩(wěn)定狀態(tài)。動(dòng)物出生后乳腺自外胚層逐漸開(kāi)始發(fā)育、生長(zhǎng)，外胚層的小葉-腺泡結(jié)構(gòu)包含形成導(dǎo)管和腺泡基底層的肌上皮細(xì)胞、排列在導(dǎo)管管腔內(nèi)的導(dǎo)管上皮細(xì)胞以及合成牛奶蛋白的BMECs[8-9]，一般體外培養(yǎng)的BMECs均含有以上3種細(xì)胞。Martignani等[10]指出差速貼壁法和差時(shí)消化法很難分離BMECs，只有經(jīng)過(guò)梯度離心等處理才可將其分開(kāi)。BMECs由單層細(xì)胞組成并合成和分泌乳汁進(jìn)入中央管腔，在導(dǎo)管的中下部形成腺泡，妊娠期分化增殖，臨近分娩時(shí)才具有分泌功能，且在干乳期存在退化現(xiàn)象[11]。Green等[12]和Barnes等[13]研究表明，家畜泌乳期過(guò)后上皮細(xì)胞的退化程度較嚙齒類動(dòng)物小，反芻家畜產(chǎn)犢后在整個(gè)產(chǎn)奶期及干奶期乳腺會(huì)發(fā)生有節(jié)制的輪回變化，當(dāng)奶牛到達(dá)干奶期或腺泡發(fā)生破裂后乳腺的恢復(fù)機(jī)制會(huì)明顯加快，之后乳房?jī)?nèi)的脂肪細(xì)胞會(huì)占據(jù)腺泡退化后騰出的空間。肌上皮細(xì)胞是圍繞腺泡和小葉內(nèi)導(dǎo)管且由分支細(xì)胞編織的籃子，主要通過(guò)收縮作用于催產(chǎn)素，從而迫使乳汁經(jīng)腺泡進(jìn)入導(dǎo)管來(lái)促使其排出[14-16]。Rudland等[17]研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子C、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及表皮生長(zhǎng)因子等的受體均可由肌上皮細(xì)胞形成。此外，越來(lái)越多的證據(jù)顯示肌上皮細(xì)胞在乳腺腫瘤進(jìn)展中的重要性[18-20]。

2 BMECs體外分離培養(yǎng)、純化及鑒定技術(shù)

2.1 BMECs的體外分離培養(yǎng)技術(shù)

目前實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的BMECs體外分離培養(yǎng)措施分別為直接通過(guò)活體或體外采集乳腺組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；利用胰蛋白酶和膠原酶等對(duì)剪碎的新鮮乳腺組織樣進(jìn)行消化，離心后分離培養(yǎng)；將新鮮乳腺組織剪成更小的碎肉后通過(guò)沉淀和過(guò)濾等方法進(jìn)行體外培養(yǎng)，或采集牛的新鮮乳汁通過(guò)反復(fù)離心進(jìn)行分離、培養(yǎng)[21]。就試驗(yàn)取材而言，對(duì)試驗(yàn)樣品要求最嚴(yán)格的是乳汁分離法，首先整個(gè)取樣過(guò)程必須嚴(yán)格消毒，確保無(wú)菌操作，乳汁中體細(xì)胞數(shù)要求少于200 000個(gè)/mL，這樣會(huì)減少免疫細(xì)胞的污染；其次對(duì)采集的新鮮乳汁必須保持和牛體內(nèi)相近的溫度(37 ℃左右)，以免BMECs活力降低或出現(xiàn)死亡。對(duì)BMECs體外分離培養(yǎng)影響較大的因素除樣本要求外，采樣時(shí)牛所處的妊娠或泌乳時(shí)期也是最關(guān)鍵的一點(diǎn)。反芻動(dòng)物分娩后具備泌乳能力，乳腺內(nèi)部的腺泡結(jié)構(gòu)在泌乳后期趨于萎縮、退化，泌乳能力降低，經(jīng)過(guò)組織重塑乳腺組織恢復(fù)到干奶期結(jié)構(gòu)。因此，乳腺腺泡發(fā)育和分化速度最快的時(shí)期處于妊娠中晚期和哺乳期，同樣是BMECs數(shù)目較多且泌乳功能最活躍的時(shí)期，在這個(gè)時(shí)間段進(jìn)行取樣最為合適。有研究利用產(chǎn)犢在6胎左右且沒(méi)有乳房及其他疾病的牛為研究對(duì)象，采集處于產(chǎn)奶中期或高峰期的乳腺組織進(jìn)行BMECs的體外培養(yǎng)，結(jié)果表明BMECs有較高的活性和成活率[22-23]。在實(shí)際應(yīng)用中不同的體外培養(yǎng)方法根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和需求均可靈活選擇。

大多數(shù)文章報(bào)道的BMECs體外分離培養(yǎng)均采用牛的乳腺組織[24-27]，然而乳腺組織內(nèi)的腺泡結(jié)構(gòu)并不是孤立的，其外圍還包被有較多的結(jié)締組織、脂肪組織和淋巴結(jié)等。由于腺泡和附屬組織的界限不是很明顯，在取材時(shí)一定要刻意避開(kāi)肉眼可見(jiàn)的非腺泡組織[2]。組織塊培養(yǎng)法最關(guān)鍵的問(wèn)題在于培養(yǎng)體系條件的控制，雖然培養(yǎng)出來(lái)的BMECs具有較高的增殖能力，培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程中沒(méi)有過(guò)高的成本，操作也不繁瑣，但消耗的時(shí)間是幾種方法里最長(zhǎng)的，而且在后期較難將BMECs完全純化出來(lái)。成纖維細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d在培養(yǎng)瓶中已清晰可見(jiàn)，而B(niǎo)MECs在培養(yǎng)7～8 d才會(huì)陸續(xù)出現(xiàn)[28]。Jedrzejczak等[29]研究表明，從小母牛身上采集的乳腺樣本是啟動(dòng)原代培養(yǎng)最有效的材料，且第2代細(xì)胞是分析乳腺功能和基因表達(dá)活性的最佳模型。Lu等[30]以產(chǎn)高脂肪、高蛋白質(zhì)乳和產(chǎn)低脂肪、低蛋白質(zhì)乳的奶牛乳腺組織作為BMECs系的來(lái)源，建立了高脂肪、高蛋白質(zhì)乳和低脂肪、低蛋白質(zhì)乳BMECs系，為研究乳脂肪、蛋白質(zhì)的基因功能及脂肪代謝機(jī)制提供了有利模型。機(jī)械破碎法除兼具組織塊培養(yǎng)法的優(yōu)勢(shì)外，還具有分離出的BMECs數(shù)目較高、有較快的增殖速度的優(yōu)勢(shì)[31]，然而此方法對(duì)細(xì)胞整體具有一定破壞性，同樣存在純化難度大的問(wèn)題[2]。酶消化法由于加快了組織裂解的速度，因此獲得細(xì)胞的速度明顯較前2種方法快且純化后成纖維細(xì)胞污染較少，國(guó)內(nèi)外研究均有報(bào)道[25,32-33]。Chen等[34]利用酶消化法在BMECs的分離中發(fā)現(xiàn)乳滴和空泡結(jié)構(gòu)。組織細(xì)胞分離中酶的選擇及消化的適時(shí)程度是培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，因此運(yùn)用酶消化法分離BMECs時(shí)研究人員對(duì)酶濃度和消化時(shí)間的把控至關(guān)重要[35-36]。由于在泌乳期乳汁中會(huì)經(jīng)常性地脫落BMECs，因此也可從乳汁中進(jìn)行體外分離。該方法簡(jiǎn)便、易于操作，最大的特點(diǎn)是采樣不受限制且分離的細(xì)胞無(wú)成纖維細(xì)胞污染，BMECs的純度較高，在體外具有較快的增殖速度，給研究者節(jié)省更多寶貴的時(shí)間。但該技術(shù)對(duì)無(wú)菌操作要求較高，分離BMECs難度稍高，因?yàn)槊庖呒?xì)胞在乳汁中的數(shù)量較大，而具有活性的BMECs數(shù)量較少，因此在實(shí)際操作中應(yīng)用的不多，盡管如此，目前有很多文獻(xiàn)報(bào)道已成功從乳汁中分離出BMECs，且純度較高[37-38]。

2.2 BMECs的純化技術(shù)

牛乳腺由不同的細(xì)胞組成，包括乳房中的上皮細(xì)胞、結(jié)締組織中的成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]。試驗(yàn)中經(jīng)?？赡苡龅降闹饕獑?wèn)題之一是成纖維細(xì)胞的攜帶，這些成纖維細(xì)胞能夠以更高的速度增殖并很大程度影響B(tài)MECs的正常生長(zhǎng)。自1961年乳腺細(xì)胞體外培養(yǎng)成功以來(lái)，研究人員經(jīng)常會(huì)被BMECs中成纖維細(xì)胞的污染而困擾[2]。為解決這一難題，近年來(lái)有研究陸續(xù)報(bào)道了各種純化方法，包括刮除法、差速貼壁法、差時(shí)消化法、密度梯度離心法、組織塊轉(zhuǎn)培法、D-纈氨酸或霍亂毒素的培養(yǎng)基法等，不同的純化方法各有特點(diǎn)。在分離培養(yǎng)初期，BMECs長(zhǎng)勢(shì)較成纖維細(xì)胞緩慢，從而導(dǎo)致2種細(xì)胞的邊界較為明顯，無(wú)用的成纖維細(xì)胞能夠用細(xì)胞刮刀或無(wú)菌槍頭通過(guò)刮除的方法分離[39-40]。刮除法雖不會(huì)對(duì)BMECs造成傷害，但純化效率較低。有學(xué)者利用成纖維細(xì)胞和BMECs對(duì)消化酶敏感性的差異將成纖維細(xì)胞分離(BMECs需要5 min，成纖維細(xì)胞則只需1～2 min)，進(jìn)而培養(yǎng)出有較高純度的BMECs[41]。差速貼壁法也是實(shí)驗(yàn)室純化BMECs的重要手段，由于BMECs與成纖維細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部貼壁的時(shí)間存在差異，成纖維細(xì)胞一般在20 min內(nèi)基本上可完成貼壁過(guò)程，而B(niǎo)MECs在同樣的生長(zhǎng)環(huán)境中可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能完成附著[42]。在實(shí)際應(yīng)用中研究人員多數(shù)會(huì)結(jié)合差速貼壁法與差時(shí)消化法，將2種方法同時(shí)用于BMECs的純化，即回避了消化酶對(duì)細(xì)胞的傷害又使得純化效率有明顯提高[43]。另外，李震等[44]和Martignani等[14]分別使用組織塊轉(zhuǎn)培法和單克隆法也實(shí)現(xiàn)了BMECs的純化。林杰等[2]通過(guò)在完全培養(yǎng)液中添加D-纈氨酸或霍亂毒素也可以得到純度較高的BMECs，但目前以上3種方法應(yīng)用相對(duì)較少。上述方法均能有效分離出成纖維細(xì)胞，但由于試驗(yàn)需求想要分離出BMECs、導(dǎo)管上皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞時(shí)卻達(dá)不到預(yù)期效果，這時(shí)就需要通過(guò)密度梯度離心法才能夠完成[45]。

2.3 BMECs的鑒定技術(shù)

體外分離培養(yǎng)、純化后會(huì)得到肉眼可見(jiàn)且具有一定形態(tài)特征的BMECs，但這并不意味著培養(yǎng)的BMECs具備牛體內(nèi)BMECs特有的增殖分化、基因或蛋白表達(dá)的功能。利用BMECs為模型進(jìn)行分子水平方面的研究前，必須對(duì)培養(yǎng)的BMECs有比較明確的形態(tài)認(rèn)識(shí)，目前BMECs鑒定最簡(jiǎn)便、直接的方法是形態(tài)學(xué)觀察法。Buehring等[46]研究表明，體外培養(yǎng)BMECs在不同的生長(zhǎng)階段會(huì)表現(xiàn)出特有的形態(tài)特征。BMECs在原代培養(yǎng)初期表現(xiàn)為單層且緊密排列，5～7 d 后，細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶底，匯集程度達(dá)90%以上，視野中可見(jiàn)鵝卵石樣、圓餅樣、多角樣具有典型BMECs形態(tài)的細(xì)胞[25,34]。細(xì)胞在進(jìn)一步傳代過(guò)程中，由之前的圓餅狀慢慢伸展開(kāi)來(lái)，形成島嶼狀聚集生長(zhǎng)的不同形態(tài)(三角形、不規(guī)則多邊形和長(zhǎng)方形)且扁平的極性細(xì)胞[29]。盡管BMECs在不同生長(zhǎng)階段有自己獨(dú)特的形態(tài)特征，但形態(tài)學(xué)觀察法的可靠性仍然較差且細(xì)胞純度無(wú)法檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)室常用的鑒定技術(shù)為標(biāo)志性骨架蛋白檢測(cè)。肌動(dòng)蛋白纖維、中等纖維及微管蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞骨架的重要組成部分，主要用于促使BMECs抵抗理化應(yīng)激和維持正常組織更新。在BMECs中表達(dá)量最高的為具有組織特異性的中等纖維，其理化性質(zhì)基本不受外界因素影響且容易檢測(cè)，是標(biāo)準(zhǔn)的角蛋白纖維，因此可作為BMECs的首選鑒定標(biāo)志物。目前用于BMECs鑒定的有角蛋白7、角蛋白8、角蛋白18，其中在實(shí)踐中廣泛應(yīng)用的是角蛋白18[47-49]。通常BMECs還會(huì)分泌很多特異性蛋白，如κ-酪蛋白、αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和αs2-酪蛋白，這些特異性蛋白的表達(dá)情況也可以作為BMECs的鑒定指標(biāo)，進(jìn)行泌乳能力和細(xì)胞類型的評(píng)價(jià)[2]。由于所有酪蛋白中β-酪蛋白占有的比例最高，為48%，試驗(yàn)中常作為BMECs培養(yǎng)成功的標(biāo)志[50]。目前對(duì)于細(xì)胞骨架蛋白和分泌蛋白所采用的鑒定方法主要有逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。RT-PCR法主要用于檢測(cè)BMECs中特異表達(dá)目標(biāo)基因的量[51]；BMECs分泌的特異性蛋白(如酪蛋白)常用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)，最大的優(yōu)點(diǎn)是具有較高的靈敏度和特異性，然而不適于大樣本量的檢測(cè)；ELISA法同樣具有很強(qiáng)的特異性，能夠彌補(bǔ)Western blot法的缺陷，但靈敏度不夠理想。

3 體外培養(yǎng)物的添加對(duì)BMECs泌乳的調(diào)控

試驗(yàn)操作過(guò)程中為了保證體外分離培養(yǎng)的BMECs維持正常的泌乳生理活性，實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用價(jià)值，研究人員便嘗試建立有效的BMECs體外培養(yǎng)體系。完全培養(yǎng)液中除了含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基與胎牛血清外，另外需添加各種激素、微量元素和小分子物質(zhì)。其中雌激素、孕酮、催產(chǎn)素、胰島素和腎上腺糖皮質(zhì)激素等與乳腺發(fā)育及泌乳密切相關(guān)[52]。段安琴等[53]在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中通過(guò)添加雌二醇和孕酮等激素成功建立了水牛乳汁分離BMECs的新方法。催乳素具有促進(jìn)BMECs生長(zhǎng)和分化的重要作用，在生物體內(nèi)催乳素能夠與非受體型酪氨酸蛋白激酶2受體特異結(jié)合，刺激腺泡發(fā)育，進(jìn)而對(duì)乳汁、乳蛋白質(zhì)和乳糖的合成與分泌具有促進(jìn)作用，同時(shí)可以維持泌乳機(jī)能的正常進(jìn)行，而乳脂的分泌基本不受影響[54]。Wu等[55]研究發(fā)現(xiàn)，在懷孕期間，未修飾的催乳素促進(jìn)乳腺生長(zhǎng)，而磷酸化后催乳素的增加抑制其生長(zhǎng)。催乳素對(duì)乳腺發(fā)育的積極作用還受到胰島素和糖皮質(zhì)激素的正向促進(jìn)，其次配體約束力和自動(dòng)磷酸化誘導(dǎo)作用可以促使胰島素受體蛋白位點(diǎn)的生成，使得胰島素亞基受體Ⅰ被激活，加快BMECs乳汁的生物合成。有研究發(fā)現(xiàn)胰島素對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[56]。張燕等[40]研究表明，完全培養(yǎng)液在添加胰島素和催乳素的基礎(chǔ)上繼續(xù)添加氫化可的松后會(huì)產(chǎn)生更加明顯的泌乳現(xiàn)象，并且對(duì)β-乳球蛋白和β-酪蛋白的表達(dá)有一定的積極響應(yīng)。此外，乳腺自身分泌的激素也會(huì)影響B(tài)MECs的分泌活動(dòng)，在含有催乳素的培養(yǎng)基中添加瘦素可以促進(jìn)α-酪蛋白和β-乳球蛋白表達(dá)升高，脂肪酸分泌增加[57]。Accornero等[58]研究還發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子也可以促進(jìn)BMECs系的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散。

隨著泌乳的持續(xù)進(jìn)行，BMECs數(shù)量的減少可能部分是由于氧化應(yīng)激所致。硒是幾種抗氧化酶的組成部分[59]，也是一種必需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素，動(dòng)物體內(nèi)缺乏硒是一個(gè)全球性的問(wèn)題，導(dǎo)致對(duì)各種疾病的易感性和生產(chǎn)性能的下降[60]。Miranda等[61]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充硒蛋氨酸可保護(hù)BMECs免受過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的凋亡，提高BMECs的抗氧化應(yīng)激能力。Zou等[62]進(jìn)行無(wú)機(jī)和有機(jī)硒對(duì)熱應(yīng)激BMECs的保護(hù)作用研究表明，42.5 ℃熱休克1 h可觸發(fā)熱休克反應(yīng)，降低細(xì)胞存活率，亞硒酸鈉蛋氨酸或亞硒酸鈉預(yù)處理細(xì)胞可有效減輕熱休克對(duì)細(xì)胞的負(fù)面影響。然而，細(xì)胞受亞硒酸鈉處理的影響較大，但對(duì)亞硒酸鈉蛋氨酸的耐受性更強(qiáng)。乳汁中的主要滲透成分葡萄糖是牛奶體積的重要決定因素，更是乳糖的主要前體物質(zhì)，Lin等[63]研究表明，葡萄糖具有誘導(dǎo)BMECs乳糖合成的能力，并對(duì)細(xì)胞活力和增殖能力有明顯提高。12 mmol/L葡萄糖濃度是誘導(dǎo)BMECs生長(zhǎng)和乳糖合成的最佳濃度。在體外，12 mmol/L葡萄糖增加了乳糖含量，并增加了參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和乳糖生物合成途徑的相關(guān)基因表達(dá)。

4 BMECs二維和三維培養(yǎng)模式的建立

1907和1912年蛙胚神經(jīng)纖維和雞的結(jié)締組織體外培養(yǎng)標(biāo)志著動(dòng)物細(xì)胞體外二維培養(yǎng)方法的建立[64]。二維細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)在于易操作、成本低、樣品重復(fù)性高及環(huán)境可控(pH、溫度、滲透壓等)等[65]。目前，很多實(shí)驗(yàn)室都在使用二維培養(yǎng)模式體外培養(yǎng)BMECs，進(jìn)行奶牛泌乳調(diào)控機(jī)理及奶牛疾病的預(yù)防與治療等方面的研究。徐丹丹等[66]和歐陽(yáng)五慶等[67]分別利用二維培養(yǎng)的方法對(duì)奶牛和山羊的MECs進(jìn)行成功分離、培養(yǎng)及鑒定。在奶牛泌乳調(diào)控方面，研究多集中于BMECs泌乳代謝相關(guān)調(diào)控因子，如乳成分合成前體物、激素對(duì)BMECs增殖、凋亡及泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響[30,68-69]。在奶牛疾病方面，主要探究BMECs炎癥標(biāo)志物的影響因素及各種致病菌對(duì)BMECs生長(zhǎng)和程序性死亡的影響[70-71]。但二維培養(yǎng)模式在常規(guī)試驗(yàn)中也存在一些不足之處，如體外生長(zhǎng)的BMECs不能重現(xiàn)生物體內(nèi)乳房的腺體結(jié)構(gòu)，也不能提供最佳的系統(tǒng)來(lái)充分了解增殖、細(xì)胞死亡和分化的調(diào)節(jié)[72-73]，盡管二維培養(yǎng)在BMECs培養(yǎng)中應(yīng)用廣泛，但學(xué)者們?cè)趯?shí)踐研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)二維培養(yǎng)的BMECs其培養(yǎng)環(huán)境還達(dá)不到體內(nèi)環(huán)境的特殊性，并且BMECs組織學(xué)特性會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加逐漸丟失，功能特性得不到完全發(fā)揮，如二維培養(yǎng)的BMECs并不能誘導(dǎo)表達(dá)κ-酪蛋白等[66]。生物體內(nèi)的組織和器官行使其重要功能離不開(kāi)特定的環(huán)境和細(xì)胞自我平衡穩(wěn)態(tài)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞更是如此，擁有和體內(nèi)生存環(huán)境相似的培養(yǎng)體系是研究細(xì)胞功能和基因表達(dá)機(jī)理的先決條件，更是試驗(yàn)成功的重要前提，因此，模擬體內(nèi)特殊環(huán)境的體外三維培養(yǎng)模式逐漸運(yùn)用而生。

與二維培養(yǎng)不同，三維培養(yǎng)模式能夠提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的類似體內(nèi)環(huán)境的多孔支架，類腺泡結(jié)構(gòu)可以在這種高仿的體外培養(yǎng)系統(tǒng)里面存活半個(gè)月或更久。三維生長(zhǎng)的BMECs表現(xiàn)出體內(nèi)乳腺上皮的許多特征，包括形成具有中空管腔的腺泡樣球，組成這些腺泡的細(xì)胞頂端基底極化，基底膜成分(Ⅳ型膠原和層黏連蛋白Ⅴ)的基底沉積，在某些情況下有乳蛋白的產(chǎn)生[65,74]。三維培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用較多的有凝膠和海綿技術(shù)、中空纖維技術(shù)、球體技術(shù)等，但膠原凝膠技術(shù)是目前最為方便、經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)方法[75]。在膠原凝膠中不同種類的細(xì)胞能夠以特有的方式移動(dòng)和匯集，到達(dá)一定時(shí)間后，經(jīng)過(guò)不斷增殖和分化形成特定的組織樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞在凝膠中的接種方式有埋植培養(yǎng)和頂部培養(yǎng)，其中頂部培養(yǎng)對(duì)于氣體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)更加靈活。目前有關(guān)三維培養(yǎng)的研究已是國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)領(lǐng)域[76-77]，Hillreiner等[78]首次建立了從鮮奶中分離出的具有生理功能的原代BMECs三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，有望揭開(kāi)泌乳生理過(guò)程的基本分子機(jī)制，如乳蛋白生產(chǎn)、細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)以及代謝紊亂等。有研究表明，三維培養(yǎng)的BMECs為κ-酪蛋白、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和蛋白激酶Bα(AKT1)基因在體內(nèi)表達(dá)的相關(guān)研究提供了較好的模型[79]，且能夠改變BMECs在培養(yǎng)基中的生存狀態(tài)、樣式及其作用，促使κ-酪蛋白的表達(dá)[66]。Zhan等[75]研究也表示在三維培養(yǎng)中，可在一定傳代范圍內(nèi)檢測(cè)到αS1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的表達(dá)，但檢測(cè)不到αS2-酪蛋白的表達(dá)，提示三維培養(yǎng)系統(tǒng)是長(zhǎng)期研究體外泌乳機(jī)制的重要工具，但三維培養(yǎng)得到的BMECs與牛體自身細(xì)胞的特性仍然存在一定差異。目前，三維培養(yǎng)技術(shù)在BMECs培養(yǎng)中的研究是一個(gè)熱點(diǎn)話題，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究已較為廣泛[80-82]。

5 BMECs體外培養(yǎng)在基因表達(dá)機(jī)理研究及組學(xué)中的應(yīng)用

BMECs作為經(jīng)典的模型一直以來(lái)被廣泛應(yīng)用于乳腺組織的生理功能等多方面的研究。李喜艷等[83]已對(duì)體外培養(yǎng)的BMECs建立乳腺生物反應(yīng)器細(xì)胞模型和在奶牛乳房疾病中的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)的概述，本文收集了近年最新文獻(xiàn)，重點(diǎn)對(duì)體外培養(yǎng)的BMECs在基因表達(dá)機(jī)理研究及組學(xué)中的研究進(jìn)行詳細(xì)闡述，為大數(shù)據(jù)和組學(xué)時(shí)代BMECs模型的應(yīng)用提供有價(jià)值的基礎(chǔ)資料。

甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，參與調(diào)節(jié)乳脂合成酶和蛋白的表達(dá)和活性，從而影響B(tài)MECs甘油三酯的合成與分泌。Xu等[25]以酶消化法成功分離的BMECs為模型，研究證明了SREBP1基因是調(diào)控乳脂合成的中心轉(zhuǎn)錄因子，SREBP1基因可能作用于細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)通路來(lái)調(diào)控過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體γ(PPARγ)的基因表達(dá)，且固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白能夠增加細(xì)胞核中SREBP1蛋白的表達(dá)，對(duì)硬脂酰輔酶A去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程具有激活效果[84]。黃牛分娩后整個(gè)泌乳過(guò)程乳腺中SREBP都具有很強(qiáng)的活性，對(duì)BMECs合成乳脂起著重要的作用[85]。Li等[86]基于基因功能研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1c基因在乳腺組織中的表達(dá)依賴于脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)正向調(diào)節(jié)，促進(jìn)乳脂的合成，并證實(shí)了FABP5是蛋氨酸(Met)和雌二醇(E2)誘導(dǎo)的SREBP-1c基因表達(dá)和乳脂合成所必需的。Kadegowda等[87]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體失活和長(zhǎng)鏈脂肪酸在不同程度上也會(huì)改變BMECs脂肪生成基因網(wǎng)絡(luò)。Chen等[88]研究發(fā)現(xiàn)，極長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶7通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子SP1調(diào)控而參與BMECs的脂質(zhì)積累。Chen等[34]又通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，證明乳脂肪球的總RNA主要來(lái)源于BMECs，可用于研究BMECs的功能基因表達(dá)，解決了哺乳動(dòng)物乳腺組織不易獲得，乳腺中基因表達(dá)水平較難檢測(cè)的問(wèn)題。二?；视娃D(zhuǎn)移酶1(DGAT1)幾乎在所有組織中表達(dá)，包括乳腺。Lu等[89]通過(guò)下調(diào)BMECs內(nèi)源性DGAT1表達(dá)，結(jié)果同樣顯著降低了BMECs中甘油三酯的含量。Wang等[90]以BMECs系為模型發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷預(yù)處理BMECs可有效抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和細(xì)胞凋亡率的升高，抑制氨水誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，挽救細(xì)胞活力的下降，進(jìn)一步說(shuō)明黃芪甲苷對(duì)氨誘導(dǎo)的BMECs損傷有保護(hù)作用。Chen等[91]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)通過(guò)TGF-β1/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)BMECs上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。BMECs過(guò)表達(dá)細(xì)胞色素P4501A1能夠減輕脂多糖誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞增殖抑制，降低了脂多糖誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子和腫瘤壞死因子[92]。

牛乳中不僅含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，還含有被認(rèn)為是由BMECs分泌的microRNAs(miRNA)。Muroya等[93]將BMECs經(jīng)催乳素(DIP)處理后，發(fā)現(xiàn)miR-148A表達(dá)水平升高可能與其泌乳期乳量增加有關(guān)。為了確定miRNA水平上如何調(diào)控牛奶中脂質(zhì)的合成和代謝，Shen等[94]采用組織塊培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)了2頭乳脂含量差異極大的中國(guó)荷斯坦奶牛的原代BMECs，分別構(gòu)建小RNA文庫(kù)，通過(guò)二代測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)共檢測(cè)到292個(gè)已知miRNAs和116個(gè)新的miRNAs。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)已知轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多種疾病。Wang等[95]通過(guò)RNA-Seq技術(shù)在牛乳腺炎BMECs模型中篩選可能具有功能的lncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA-TUB在接受促炎刺激的BMECs中的表達(dá)高于正常細(xì)胞。Ma等[96]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA XIST(調(diào)控X染色體失活)介導(dǎo)BMECs炎癥反應(yīng)通過(guò)核因子-κB/炎性小體3(NF-κB/NLRP3)途徑完成。Xu等[97]利用脂多糖刺激BMECs后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，提示白細(xì)胞介素-1(IL-1)介導(dǎo)的BMECs通透性增加是通過(guò)IL-1β-ERK1/2-肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)軸途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Li等[98]將BMECs暴露在熱應(yīng)激下，并將它們與對(duì)照組進(jìn)行比較，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行相對(duì)和絕對(duì)定量，與對(duì)照組相比，熱處理組鑒定出104個(gè)差異升高的蛋白質(zhì)(>1.3倍)和167個(gè)差異降低的蛋白質(zhì)(<0.77倍)。大多數(shù)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)與細(xì)胞-底物連接組裝、分解代謝過(guò)程和代謝過(guò)程相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外利用體外分離培養(yǎng)的BMECs進(jìn)行組學(xué)分析的報(bào)道還相對(duì)較少，更多的是通過(guò)乳腺組織直接測(cè)序分析[92,99-100]。然而B(niǎo)MECs是乳腺的基本功能單位，體外培養(yǎng)的原代BMECs較好地保留了乳腺組織原有的合成和分泌特性，因此是探討乳腺泌乳特性和代謝調(diào)控機(jī)制的重要輔助研究手段。

6 小 結(jié)

BMECs體外二維培養(yǎng)技術(shù)目前日趨成熟，通常以乳腺組織分離培養(yǎng)和酶消化法連用，操作簡(jiǎn)單且效果最佳，然而不可避免會(huì)受到成纖維細(xì)胞的影響。乳汁分離法恰好可以彌補(bǔ)這個(gè)缺陷，分離的BMECs純度較高，需要注意的是試驗(yàn)過(guò)程中特別注重規(guī)范的無(wú)菌操作。在分離培養(yǎng)初期為了使體外培養(yǎng)的BMECs具有和體內(nèi)細(xì)胞盡可能相同的性狀和功能，會(huì)添加一些激素和小分子，使得細(xì)胞具有正常泌乳生理活性和分化狀態(tài)，且效果也得到了證實(shí)。盡管如此，二維培養(yǎng)的BMECs其生長(zhǎng)和增殖的環(huán)境還達(dá)不到生物體自身?xiàng)l件的特殊性，并且BMECs組織學(xué)特性會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加逐漸丟失，功能特性得不到完全發(fā)揮，因此，三維細(xì)胞培養(yǎng)作為一項(xiàng)新興的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)逐漸被人們所重視，其最大的優(yōu)勢(shì)在于能夠提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的類似體內(nèi)環(huán)境的多孔支架，類腺泡結(jié)構(gòu)可以在這種高仿的體外培養(yǎng)系統(tǒng)里面存活半個(gè)月或更久，因而具有極大的可開(kāi)發(fā)性。然而目前三維培養(yǎng)得到的細(xì)胞生存和分化能力有限，與牛體自身細(xì)胞的特性仍然存在一定差異，且受到成本的制約，還有待科研人員更深入地探索和研究。雖然細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)還在不斷地改進(jìn)和完善，但體外分離培養(yǎng)的BMECs已在牛乳房疾病和基因表達(dá)機(jī)理研究中廣泛應(yīng)用。不僅如此，目前已有研究報(bào)道將BMECs和組學(xué)關(guān)聯(lián)起來(lái)進(jìn)行差異基因、非編碼序列及蛋白的篩選，尋找調(diào)控泌乳或和疾病相關(guān)的新基因和蛋白，因此是探討乳腺泌乳特性和代謝調(diào)控機(jī)制的重要研究手段，具有很好的應(yīng)用前景。