劉子豪 蔣林樹 南雪梅 熊本海*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

MicroRNA(miRNA)是一種長度為18～25 nt的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，在不同物種間高度保守，其通過誘導(dǎo)mRNA的降解或阻斷其翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1-2]。多項(xiàng)研究表明，miRNA與乳腺、骨骼肌[3]、卵泡[4]、肝臟[5]、晶狀體[6]、免疫細(xì)胞[7]等幾乎所有組織、器官、細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)。哺乳動(dòng)物乳腺是動(dòng)物體中少數(shù)反復(fù)經(jīng)歷發(fā)育、功能分化和退化的器官之一。乳腺發(fā)育和泌乳是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多種激素、細(xì)胞因子及miRNA等的共同調(diào)控[8]。從理論上講，了解乳腺發(fā)育和泌乳的精準(zhǔn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于更好地了解乳腺生理功能及調(diào)節(jié)規(guī)律至關(guān)重要；從生產(chǎn)上講，我國對(duì)奶牛生產(chǎn)的需求已經(jīng)從過去單方面追求產(chǎn)量轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)質(zhì)量和產(chǎn)量的雙重追求，最大程度地調(diào)動(dòng)乳腺潛能，是行業(yè)需求。因此，本文擬從激素對(duì)乳腺miRNA表達(dá)譜的調(diào)控及乳腺miRNA對(duì)激素受體及其下游通路的調(diào)控2個(gè)角度，揭示奶牛乳腺激素相關(guān)miRNA的研究進(jìn)展及方向，以期助力于乳腺生物學(xué)的發(fā)展及奶產(chǎn)品質(zhì)量的提高。

1 激素對(duì)乳腺miRNA表達(dá)譜的影響

乳腺組織的miRNA表達(dá)譜在不同泌乳階段存在差異[9]，并能對(duì)細(xì)菌侵襲[10-11]、熱應(yīng)激[12]、營養(yǎng)[13]等環(huán)境改變產(chǎn)生應(yīng)答。在此過程中，激素，尤其是泌乳相關(guān)激素，是誘導(dǎo)乳腺miRNA變化的重要原因之一。

研究表明，地塞米松、胰島素(INS)、催乳素(PRL)等生乳激素能夠改變奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)miRNA的表達(dá)譜。Muroya等[14]研究表明，生乳激素的添加顯著降低BMEC中miR-21-5p、miR-26a及miR-320a的表達(dá)，并減少培養(yǎng)基中miR-339a的豐度，同時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中miR-148表達(dá)上調(diào)。此外，有報(bào)道牛乳中miR-148a的含量在哺乳第5個(gè)月開始減少[15-16]，說明激素誘導(dǎo)的miRNA與乳蛋白合成、乳腺發(fā)育和細(xì)胞成熟度有關(guān)?；诎谢蝾A(yù)測(cè)的生物信息學(xué)分析揭示，在BMEC中被下調(diào)的miRNA與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化和導(dǎo)管發(fā)育等生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)[14]。

Jiao等[17]探討了PRL/miR-183/胰島素受體底物1(IRS1)途徑調(diào)控奶牛乳脂代謝的分子機(jī)制。該研究中，用不同濃度PRL處理BMEC后，在一定的濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，miR-183的表達(dá)與PRL存在相關(guān)性。為了確定PRL改變miR-183表達(dá)的機(jī)制，研究進(jìn)一步使用甲基化抑制劑(5-aza-dc)處理BMEC，結(jié)果表明，5-aza-dc可部分抑制PRL介導(dǎo)的miR-183的下調(diào)，用亞硫酸氫DNA測(cè)序法檢測(cè)PRL組和PRL+5-aza-dc組的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)5-aza-dc處理抑制了PRL誘導(dǎo)的DNA甲基化，證實(shí)PRL可以通過BMEC甲基化作用抑制miR-183的表達(dá)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，IRS1在泌乳高峰期的乳腺組織中高表達(dá)，而miR-183的表達(dá)水平與IRS1表達(dá)負(fù)相關(guān)，miR-183可能與IRS1基因的3′UTR位點(diǎn)結(jié)合，并負(fù)調(diào)控IRS1基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)。

此外，萬中英等[18]針對(duì)中藥王不留行增乳活性單體鄰苯二甲酸二丁酯和PRL對(duì)乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)源性miRNAs表達(dá)的影響開展了研究，結(jié)果兩者均可以抑制原代培養(yǎng)的泌乳中期BMEC中miRNA-143、miRNA-125和miRNA-195表達(dá)，該研究進(jìn)一步證實(shí)激素可以改變奶牛乳腺miRNA表達(dá)譜，從而發(fā)揮后續(xù)調(diào)控作用。

除奶牛外，研究表明激素對(duì)其他物種乳腺miRNA表達(dá)同樣具有影響。Hanan等[19]通過小鼠乳腺上皮細(xì)胞系中獲得腺泡前體細(xì)胞、導(dǎo)管前體細(xì)胞和多能前體克隆細(xì)胞，其中，腺泡前體細(xì)胞中miR-146b的表達(dá)明顯高于后兩者。在單獨(dú)使用PRL或雌激素和孕酮結(jié)合的激素刺激后，顯著上調(diào)miR-146b的表達(dá)[20]。由于研究目的的不同，小鼠等模式動(dòng)物的研究更傾向于病理機(jī)制的探討，而奶牛則更傾向于乳腺生理功能的了解，但是毋庸置疑，奶牛乳腺中激素對(duì)miRNA的影響的研究，尚需更多發(fā)掘和拓展。

2 miRNA對(duì)激素受體及其下游信號(hào)通路的調(diào)控

2.1 對(duì)催乳素受體及其下游信號(hào)通路的調(diào)控

PRL是一種最為重要的生乳激素，在乳腺發(fā)育、泌乳啟動(dòng)、乳汁生成等方面發(fā)揮重要作用。多種miRNA可以通過PRL、催乳素受體(PRLR)及其下游信號(hào)通路，參與PRL誘導(dǎo)的生物學(xué)進(jìn)程。

泌乳啟動(dòng)需要自分泌PRL進(jìn)行誘導(dǎo)，而磷酸酶(PTEN)-磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)-蛋白激酶(AKT)信號(hào)通路能夠內(nèi)源性調(diào)節(jié)PRL的水平[21]。研究證實(shí)，PTEN基因是miR-29b在調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育中的重要靶標(biāo)，PTEN信號(hào)蛋白對(duì)于PRL自分泌的活動(dòng)至關(guān)重要[22]。此外，在Do等[23]針對(duì)miRNA在整個(gè)泌乳期的時(shí)間表達(dá)模式進(jìn)行的研究中證實(shí)，miR-29b/miR-363是乳腺從初乳向常乳生成過渡期信號(hào)的重要調(diào)節(jié)物，而泌乳階段之間過渡的相關(guān)信號(hào)通路涉及細(xì)胞凋亡[PTEN和應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)/氨基末端激酶(JNK)]、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[蛋白激酶A、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)]、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)]、細(xì)胞因子、激素和生長因子等。這說明miRNA可以通過PTEN對(duì)PRL及其受體表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用。

另一個(gè)廣受關(guān)注的能夠靶向PRLR的miRNA是miR-142-3p。小鼠乳腺研究中證實(shí)，miR-142-3p能夠通過PRLR介導(dǎo)的多個(gè)信號(hào)通路改變小鼠乳腺的結(jié)構(gòu)及泌乳功能[24]。奶牛乳腺中miR-142-3p功能及機(jī)制研究有限，于蕾等[25]發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p在不同乳品質(zhì)的奶牛乳腺組織中均有表達(dá)，但相比于處于泌乳期的高乳品質(zhì)乳腺組織和干奶期乳腺組織，泌乳期低乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達(dá)量最高，證明miR-142-3p在調(diào)控奶牛乳腺的泌乳功能上發(fā)揮作用，在以BMEC為模型的功能學(xué)研究中進(jìn)一步證實(shí)，miR-142-3p沉寂后，可以通過改變其靶基因PRLR的表達(dá)及其下游信號(hào)通路的活性，最終增加BMEC合成β-酪蛋白及甘油三酯的能力。由此可見，miR-142-3p可以通過激素受體及其下游通路，完成對(duì)乳腺泌乳的調(diào)控。

2.2 對(duì)生長激素受體及其下游信號(hào)通路的調(diào)控

乳腺的發(fā)育由生長激素(GH)、雌激素、孕激素和PRL等的復(fù)雜相互作用所調(diào)控。GH與生長激素受體(GHR)的結(jié)合觸發(fā)了受非受體型酪氨酸蛋白激酶(JAK2)誘導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[26]。整體上講，GHR通過JAK2下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活(STAT)途徑調(diào)節(jié)酪蛋白的生成[27-28]，通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)整[27]，通過蛋白激酶C(PKC)途徑改變葡萄糖代謝，通過IRS途徑維持細(xì)胞的生長、分裂和代謝[29]。因此，研究miRNA通過靶向GHR調(diào)節(jié)奶牛乳腺發(fā)育、泌乳及乳品品質(zhì)生成的機(jī)制具有重要意義。

miR-139是奶牛乳腺中發(fā)現(xiàn)的靶向GHR的最重要miRNA之一。Cui等[30]研究發(fā)現(xiàn)，miR-139在泌乳中期奶牛乳腺組織中的表達(dá)較妊娠中期下調(diào)，根據(jù)miR-139在奶牛泌乳過程中的作用，對(duì)其2個(gè)潛在的靶基因GHR和胰島素樣生長因子受體(IGF1R)進(jìn)行了研究。雙熒光素酶報(bào)告基因方法證實(shí)miR-139能夠與GHR和IGF1R的3′UTR直接結(jié)合，功能學(xué)研究表明miR-139的過表達(dá)或沉默改變了BMEC中GHR和IGF1R的mRNA及蛋白表達(dá)水平。此外，miR-139的過表達(dá)降低了β-酪蛋白的生成，下調(diào)GHR及IGF1R通路中關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)，抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，而沉默miR-139則與之相反。沉默GHR降低了β-酪蛋白、IGF1R和IGF1R途徑關(guān)鍵信號(hào)分子的蛋白水平，而聯(lián)合沉默miR-139和GHR則提高了GHR的表達(dá)水平并逆轉(zhuǎn)了GHR的沉默效應(yīng)。研究表明，GH可以通過刺激肝臟分泌IGF1間接作用于乳腺，誘導(dǎo)乳腺中miRNA表達(dá)的改變[31]。以上研究證實(shí)，GHR和IGF1R是奶牛乳腺中miR-139的靶基因，miR-139可通過靶向GHR和IGF1R改變其下游信號(hào)通路，從而抑制BMEC中β-酪蛋白的合成和細(xì)胞增殖。

另一個(gè)已被證實(shí)直接靶向GHR的miRNA是bta-miR-15a。bta-miR-15a位于牛12號(hào)染色體18 887 743～18 887 825 bp[32]，在細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞周期[33]和死亡[34-35]調(diào)節(jié)中起重要作用。Li等[36]針對(duì)miR-15a在奶牛乳腺中的表達(dá)和功能開展了研究。結(jié)果表明，bta-miR-15a可以調(diào)節(jié)荷斯坦奶牛乳腺的發(fā)育，利用TargetScan5.1軟件預(yù)測(cè)GHR基因是bta-miR-15a的潛在靶基因。研究進(jìn)一步將bta-miR-15a模擬物或抑制劑分別轉(zhuǎn)染BMEC，隨后采用定量實(shí)時(shí)PCR、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)和CASY-TT等技術(shù)對(duì)泌乳相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究和分析，確定bta-miR-15a與GHR的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)轉(zhuǎn)染bta-miR-15a mimic時(shí)，bta-miR-15a的表達(dá)比內(nèi)源性水平提高8.4倍，同時(shí)GHR的表達(dá)降低，當(dāng)轉(zhuǎn)染bta-miR-15a抑制劑時(shí)則效果相反。Western blot結(jié)果表明，bta-miR-15a轉(zhuǎn)染可降低GHR和酪蛋白的表達(dá)。由此說明，bta-miR-15a能夠在翻譯水平上抑制GHR蛋白的表達(dá)，間接影響酪蛋白的合成，其作用機(jī)制可能是miR-15a抑制GHR的調(diào)節(jié)作用，從而影響JAK2-STAT5信號(hào)通路，并最終降低β-酪蛋白的生成。

2.3 其他激素相關(guān)miRNA

除PRL及GH外，還有多種激素在乳腺發(fā)育和泌乳調(diào)控中發(fā)揮作用。瘦素(leptin)是脂肪細(xì)胞分泌的內(nèi)分泌/旁分泌激素。在乳腺中，脂肪墊及脂肪細(xì)胞合成的瘦素能夠與其他激素互作，發(fā)揮重要作用。研究表明，瘦素能夠增加PRL的生乳能力[37]，PRL、瘦素和雌激素的聯(lián)合會(huì)增加β-乳球蛋白的表達(dá)[38]，瘦素受體(LEPR)則在哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)育、泌乳及退化過程中起重要作用[39]。門晶等[40]采用靶基因預(yù)測(cè)軟件，發(fā)現(xiàn)LEPR是miR-30d的潛在靶基因。該研究首先構(gòu)建了包含與miR-30d靶向結(jié)合的LEPR序列的重組熒光素酶報(bào)告載體，將miR-30d與重組熒光素酶載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行片段化，檢測(cè)熒光素酶活性，該研究確定LEPR是miR-30d的靶基因，并參與調(diào)控奶牛乳腺的生長發(fā)育和泌乳功能。

此外，對(duì)乳腺而言，INS是另一個(gè)重要的調(diào)節(jié)激素。INS一方面可以增加乳產(chǎn)量[41]，另一方面與乳腺細(xì)胞的發(fā)育、存活及營養(yǎng)分配密切相關(guān)[42-43]。Wang等[9]在對(duì)奶牛產(chǎn)后30 d乳腺組織miRNA及其靶基因表達(dá)進(jìn)行聯(lián)合分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，胰島素受體(INSR)可能是miR-15/16、miR-181a、miR-221、miR-223的作用靶點(diǎn)。其中，miR-221在泌乳早期的表達(dá)低于泌乳高峰期，而miR-223則相反。此外，雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因方法表明，IRS1、STAT5A及STAT3是miR-221的靶基因[44]。隨后的分析揭示，miR-221模擬物的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致STAT5A和IRS1在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)顯著降低。同時(shí)，miR-221轉(zhuǎn)染后，JAK-STAT和PI3K-AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路中受STAT5A和IRS1調(diào)節(jié)的下游分子細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)、AKT3和mTOR的表達(dá)均發(fā)生了變化。該研究證實(shí)，miR-221通過靶向STAT5A和IRS1(PI3K-Akt/mTOR和JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因)抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖。

3 小 結(jié)

乳腺是一種獨(dú)特的組織，在成年期經(jīng)歷細(xì)胞增殖、分化和凋亡的周期。乳腺的發(fā)育是通過內(nèi)分泌激素，包括GH、孕激素、PRL及其他激素相互作用，完成乳腺的周期性變化及泌乳功能的調(diào)節(jié)。miRNA作為調(diào)節(jié)生物學(xué)功能和乳腺發(fā)育的一類分子不容忽視。一方面，激素可以通過對(duì)miRNA表達(dá)譜的影響，完成對(duì)更多生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，使激素作用的范圍更加深廣;另一方面，miRNA通過直接靶向激素受體及其下游信號(hào)通路分子，參與到激素相關(guān)的調(diào)節(jié)功能中，使信號(hào)的傳遞更完善，使調(diào)節(jié)更精準(zhǔn)。

雖然針對(duì)miRNA在牛乳腺中的特殊生物學(xué)作用多有研究報(bào)道，但與乳腺激素有關(guān)的miRNA在牛乳腺中的作用機(jī)制還有待完善，這方面相關(guān)研究的深入和拓展可以為更好地了解乳腺生物學(xué)提供助益，更為促進(jìn)乳腺健康、提高乳腺泌乳能力提供必要的理論信息和指導(dǎo)方向。