李文成 趙旭民 張延軍 宋 煒,4 曾 霖 張 惠 趙向炯

(1.浙江海洋大學(xué)國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，舟山316000；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海200090； 3.浙江華太生物科技有限公司，義烏322005；4.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，青島266237)

大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)是我國(guó)南方沿海重要海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，其營(yíng)養(yǎng)豐富、口感鮮美，備受廣大消費(fèi)者的青睞[1]。自從20世紀(jì)80年代大黃魚(yú)大批量人工育苗技術(shù)獲得突破以來(lái)，其養(yǎng)殖業(yè)在福建、廣東、浙江等地得到了迅速發(fā)展[2]。然而，冬春季大黃魚(yú)繁殖期間，其仔稚魚(yú)死亡率高，尤其是在浙江養(yǎng)殖區(qū)域。低溫使魚(yú)類處于脅迫生理狀態(tài)，可能導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢、免疫力低下、疾病頻繁爆發(fā)[3-4]。當(dāng)前，養(yǎng)殖戶濫用抗生素來(lái)防治和治理環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)的魚(yú)類疾病，這容易引起魚(yú)類機(jī)體和水環(huán)境抗生素藥物殘留和病原菌耐藥性等問(wèn)題，影響了水產(chǎn)品和水環(huán)境安全，并阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色發(fā)展。

當(dāng)魚(yú)類遭受環(huán)境脅迫時(shí)，導(dǎo)致活性氧(oxygen species,ROS)大量產(chǎn)生[5]。若機(jī)體不能有效控制ROS含量，將會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)羰基化、脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA合成障礙等危害，從而導(dǎo)致魚(yú)類生理功能失常[6]。魚(yú)類可以通過(guò)抗氧化系統(tǒng)控制ROS過(guò)量產(chǎn)生，從而維持機(jī)體氧化還原平衡。環(huán)境脅迫能夠上調(diào)抗氧化酶如過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)等基因的表達(dá)[7]。非酶抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione,GSH)可與抗氧化酶協(xié)同作用，共同抑制ROS過(guò)量產(chǎn)生[8]。另外，魚(yú)類的非特異性免疫系統(tǒng)在緩解脅迫誘導(dǎo)的損傷方面也發(fā)揮著重要作用，且與抗氧化系統(tǒng)密切相關(guān)[9]。作為非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，溶菌酶(lysozyme,LZM)和堿性磷酸酶(alkaline phophatase,AKP)基因表達(dá)水平通常被用作評(píng)價(jià)環(huán)境脅迫、細(xì)菌感染、免疫刺激劑等作用效應(yīng)的分子生物標(biāo)記物[10]。

基因表達(dá)水平主要受控于核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factors,NFs)。在哺乳動(dòng)物中，NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)均能被ROS誘導(dǎo)激活，激活的Nrf2和NF-κB分別結(jié)合到抗氧化酶和非特異性免疫酶相關(guān)基因的順式作用元件，從而調(diào)控這些目的基因的表達(dá)[11-12]。因此，Nrf2和NF-κB分別在抗氧化反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

小肽又稱為短肽、寡肽，是一類由蛋白質(zhì)水解、易消化吸收且具有多種生物功能的小分子物質(zhì)[13]。它能顯著提高水生動(dòng)物的攝食量、飼料效率及機(jī)體蛋白質(zhì)合成能力，從而促進(jìn)它們的生長(zhǎng)。小肽也能改善水生動(dòng)物的抗氧化性能和非特異性免疫力，從而降低發(fā)病率和提高抗逆性。已有研究表明，飼料中添加小肽可提高魚(yú)類的抗氧化能力和非特異性免疫力[14-15]，也能改善凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的抗病力[16]。然而，有關(guān)小肽營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化活餌料對(duì)魚(yú)類生理影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)用小肽營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)投喂于大黃魚(yú)仔魚(yú)，以探討小肽對(duì)其生長(zhǎng)和小腸發(fā)育的影響，然后將大黃魚(yú)仔魚(yú)低溫暴露24 h，以探討小肽對(duì)低溫脅迫下大黃魚(yú)仔魚(yú)抗氧化能力和非特異性免疫力的影響，該研究成果可為大黃魚(yú)仔魚(yú)養(yǎng)殖中小肽最佳營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化濃度提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也可為小肽緩解環(huán)境脅迫對(duì)魚(yú)類損傷的研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 小肽制備

利用豬小腸生產(chǎn)肝素鈉的下腳料腸黏膜為原料，采用堿性水解蛋白酶和胰蛋白酶裂解制備小肽。使用凝膠色譜法測(cè)定小肽分子質(zhì)量組成，分子質(zhì)量小于2.0 ku的占80%以上。小肽氨基酸組成采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246—2000中方法測(cè)定，氮、五氧化二磷、氧化鉀和有機(jī)質(zhì)采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2012中方法測(cè)定，其主要成分見(jiàn)表1。

表1 小肽主要成分(濕重基礎(chǔ))

1.1.2 輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化

輪蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化：將寧德霞浦育苗場(chǎng)水泥池培育的褶皺臂尾輪蟲(chóng)(Brachionusplicatilis)以100～120條/mL的密度轉(zhuǎn)移到5個(gè)容量為1 000 L的鋼化玻璃桶的水體(海水800 L)中，加入小肽(體積百分濃度約為86.50%)，使得水體中小肽濃度分別為0、0.5、1.0、2.0和3.0 mL/m3，在水溫為(24.1±3.4) ℃、鹽度為26.12±0.35、光照為3 000 lx的條件下進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化。7 d以后，用250目尼龍篩絹網(wǎng)袋過(guò)濾收集10%體積的輪蟲(chóng)用于大黃魚(yú)仔魚(yú)投喂，然后再加入相同濃度和體積的小肽溶液，每天4次。將小肽濃度為0和2.0 mL/m3養(yǎng)殖桶中所收集的輪蟲(chóng)樣本(20 mL)保存于-20 ℃冰箱，取樣3次，用于粗蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成測(cè)定。

鹵蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化：將寧德霞浦育苗場(chǎng)孵化的鹵蟲(chóng)Ⅰ齡無(wú)節(jié)幼體(體內(nèi)卵黃已耗盡)按45～50 條/mL的密度放入5個(gè)容量為1 000 L的鋼化玻璃桶水體(海水800 L)中，加入小肽(體積百分濃度約為86.50%)，使得水體中小肽濃度分別為0、0.5、1.0、2.0和3.0 mL/m3，在水溫為(26.0±2.3) ℃、鹽度為26.12±0.35、自然光照的條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化24 h后，用250目尼龍篩絹網(wǎng)袋過(guò)濾收集鹵蟲(chóng)用于大黃魚(yú)仔魚(yú)投喂。將小肽濃度為0和2.0 mL/m3養(yǎng)殖桶中所收集的鹵蟲(chóng)樣本(20 mL)保存于-20 ℃冰箱中，取樣3次，用于粗蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)1：大黃魚(yú)仔魚(yú)生長(zhǎng)試驗(yàn)

從寧德霞浦育苗場(chǎng)購(gòu)買7.5萬(wàn)尾左右剛孵化出的大黃魚(yú)仔魚(yú)，放入15個(gè)容積為300 L的鋼化玻璃桶中飼養(yǎng)，約5 000尾/桶。將15桶試驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)分為5組，每組3桶(重復(fù))，采用靜水充氣養(yǎng)殖，每天換水2次(08:00和16:00)，換水率為60%。水質(zhì)參數(shù)如下：水溫為(24.1±3.4) ℃，鹽度為26.12±0.35，pH為7.67±0.31；總氨氮濃度為(0.15±0.02) mg/L～(0.20±0.03) mg/L，各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。將經(jīng)0、0.5、1.0、2.0和3.0 mL/m3小肽營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化好的輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)按圖1的投喂策略投喂5組大黃魚(yú)仔魚(yú)，并分別命名為對(duì)照組、S0.5組、S1.0組、S2.0組和S3.0組。每天投喂4次，投喂間隔6 h。大黃魚(yú)仔魚(yú)攝食0.5 h之后剩余少量的輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)即可停止投喂。試驗(yàn)結(jié)束后，每桶隨機(jī)取10尾魚(yú)，用精度為0.1 mm的游標(biāo)卡尺測(cè)量體長(zhǎng)。每桶隨機(jī)取4尾魚(yú)，用4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)固定，用于組織切片觀察。組織切片制作具體步驟[17]如下：首先，樣品采用梯度乙醇使其脫水，水楊酸甲酯透明，石蠟包埋；然后，用石蠟切片機(jī)切成矢狀切片(厚度為4～6 μm)，并用蘇木素-伊紅(HE)染色；最后，用光學(xué)顯微鏡觀察切片，用分析軟件Image-pro plus 6.0(Media Cybernetics, Inc.,美國(guó))隨機(jī)選取5處測(cè)量小腸絨毛高度(mm)(圖2中紅色線段)，計(jì)數(shù)視野內(nèi)絨毛數(shù)量并測(cè)量組織面積(mm2)，并求出單位面積內(nèi)絨毛數(shù)量(個(gè)/mm2)(圖3)。

圖1 輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)投喂策略

圖2 大黃魚(yú)仔魚(yú)小腸絨毛高度示意圖

圖3 大黃魚(yú)仔魚(yú)小腸絨毛數(shù)量和組織面積示意圖

1.2.2 試驗(yàn)2：大黃魚(yú)仔魚(yú)低溫脅迫試驗(yàn)

選擇21個(gè)容量為70 L的塑料桶，分為7組，每組3個(gè)桶(重復(fù))。按圖4所示，從試驗(yàn)1對(duì)應(yīng)的鋼化玻璃桶中隨機(jī)取200尾魚(yú)放入塑料桶中。2組采用常溫處理，另外5組采用低溫處理，分別命名為S0常溫組、S1.0常溫組、S0低溫組、S0.5低溫組、S1.0低溫組、S2.0低溫組和S3.0低溫組。降溫方式如下：將養(yǎng)殖桶水體溫度以3 ℃/h降至12 ℃(自然海水溫度)，然后將12 ℃水溫維持24 h。試驗(yàn)結(jié)束后取樣，每桶取4尾試驗(yàn)魚(yú)用于ROS和GSH含量測(cè)定，另取4尾試驗(yàn)魚(yú)的肝臟用于基因表達(dá)測(cè)定。所有樣本先放于液氮中，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱中保存。

圖4 試驗(yàn)組示意圖

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 粗蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成

采用凱氏定氮法測(cè)定輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)中粗蛋白質(zhì)含量。參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246—2000的方法進(jìn)行樣品處理，采用高效液相色譜儀測(cè)定其氨基酸組成。

1.3.2 ROS和GSH含量測(cè)定

全魚(yú)均漿液制備參照Z(yǔ)eng等[18]的方法。向全魚(yú)中加入9倍的4 ℃緩沖液[1 mmol/L 4-(2-氨甲基)苯磺酰氟鹽酸、1 mmol/L苯甲脒、2 mmol/L二硫蘇糖醇、5 mmol/L乙二胺四乙酸、80 mmol/L氨基丁三醇，pH 7.6)，勻漿后制成10%勻漿液。在4 ℃下以900 r/min離心10 min，取上清，采用Bradford方法測(cè)量蛋白質(zhì)含量，使用試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)采用分光光度法測(cè)定ROS和GSH含量。

1.3.3 抗氧化和非特異性免疫相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

續(xù)表2基因名稱Gene names引物序列Primer sequences (5'—3')基因長(zhǎng)度Gene length/bpPCR擴(kuò)增效率PCR amplification efficiency谷胱甘肽還原酶GRF:AGCCAAAACAGCCGTGATR:CGGCTAACATAAGCATCCC1260.98NF-E2相關(guān)因子2Nrf2F:CCCTCAAAATCCCTTTCACTR:GCTACCTTGTTCTTGCCGC900.96c型溶菌酶c-type LZMF:CCAGAGCCATCAACCACAACACTR:GATCGCCACGCTGACATCATC1520.97g型溶菌酶g-type LZMF:TCAGCCAAGGCACCGACATR:GCATCCACCGCTTCATAGCA1481.04堿性磷酸酶AKPF:TCAGCAGACTCCCGTCCCTCR:GTTGTCCAGTTCGCAGTTCTCATAG1750.98核轉(zhuǎn)錄因子-κBNF-κBF:TGCGGCTCGTGCGGATAR:GCGGCTTCAACTGGACTGC1171.05β-肌動(dòng)蛋白β-actinF:TCGTCGGTCGTCCCAGGCATR:ATGGCGTGGGGCAGAGCGT1821.05

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)單因素方差分析(one-way ANOVA)后，若存在顯著差異，再采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小肽對(duì)輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化效果

與對(duì)照組相比，S2.0組輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)的粗蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著變化(P>0.05)(表3)。與對(duì)照組相比，S2.0組輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)的必需氨基酸(EAA)和總氨基酸(TAA)含量顯著增加(P<0.05)，但2組之間的EAA/TAA差異不顯著(P>0.05)(表4)。

表3 小肽對(duì)輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)粗蛋白質(zhì)含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表4 小肽對(duì)輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)氨基酸組成的影響(占粗蛋白質(zhì)的百分比)

續(xù)表4氨基酸Amino acids輪蟲(chóng) Rotifers對(duì)照組Control groupS2.0組S2.0 group鹵蟲(chóng) Artemia nauplii對(duì)照組Control groupS2.0組S2.0 group甘氨酸 Gly4.37±0.295.14±0.22*3.37±0.293.64±0.25丙氨酸 Ala3.02±0.233.88±0.24*4.08±0.344.78±0.24*纈氨酸 Val2.96±0.143.73±0.21*3.12±0.243.62±0.21蛋氨酸 Met0.59±0.040.71±0.10*0.64±0.060.76±0.09異亮氨酸 Ile2.63±0.163.29±0.28*2.40±0.152.73±0.13*亮氨酸 Leu4.08±0.245.25±0.22*3.94±0.244.29±0.14酪氨酸 Tyr2.86±0.193.39±0.22*2.75±0.212.96±0.40苯丙氨酸 Phe2.71±0.143.46±0.19*1.66±0.151.81±0.19賴氨酸 Lys3.89±0.275.16±0.24*5.86±0.506.72±0.38組氨酸 His0.63±0.070.74±0.071.47±0.111.58±0.10精氨酸 Arg1.87±0.152.24±0.12*5.24±0.326.13±0.48脯氨酸 Pro3.08±0.293.68±0.19*3.36±0.193.73±0.26必需氨基酸 EAA19.20±1.1524.57±1.53*20.53±1.6723.38±1.91總氨基酸 TAA46.47±1.3357.59±1.66*58.33±1.8365.17±2.07*必需氨基酸/總氨基酸 EAA/TAA41.32±1.1642.65±1.1335.18±1.3235.71±1.35

2.2 小肽對(duì)大黃魚(yú)仔魚(yú)生長(zhǎng)和小腸發(fā)育的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，投喂由4種不同濃度小肽營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)均能促進(jìn)大黃魚(yú)仔魚(yú)的生長(zhǎng)，使其體長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)。根據(jù)小肽濃度和大黃魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng)的二元回歸分析，小肽最佳營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化濃度為1.88 mL/m3(圖5)。與對(duì)照組相比，4種不同濃度小肽組的小腸絨毛高度均顯著增加(P<0.05)，尤其是S1.0組；S1.0組和S3.0組的小腸絨毛數(shù)量顯著增多(P<0.05)；S1.0組和S2.0組的小腸組織面積顯著增大(P<0.05)。然而，小腸單位面積內(nèi)絨毛數(shù)量不受小肽濃度的顯著影響(P>0.05)(表3)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示顯著差異(P<0.05)。圖6同。

表5 小肽對(duì)大黃魚(yú)仔魚(yú)小腸絨毛形態(tài)的影響

2.3 小肽對(duì)大黃魚(yú)仔魚(yú)ROS和GSH含量的影響

由圖6可知，與S0常溫組相比，S1.0常溫組和S3.0低溫組的ROS含量顯著降低(P<0.05)，S0低溫組、S0.5低溫和S2.0低溫組的ROS含量顯著升高(P<0.05)。與S0常溫組相比，除S0低溫組的GSH含量顯著降低(P<0.05)外，而小肽在常溫和低溫條件下均能顯著增加大黃魚(yú)仔魚(yú)的GSH含量(P<0.05)。

圖6 小肽對(duì)低溫脅迫下大黃魚(yú)仔魚(yú)ROS(A)和GSH(B)含量的影響

2.4 小肽對(duì)大黃魚(yú)仔魚(yú)肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

由表6可知，與S0常溫組相比，S1.0常溫組的銅鋅超氧化物歧化酶(copper-zinc superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-1a(glutathione peroxidase-1a,GPx-1a)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-1b(glutathione peroxidase-1b，GPx-1b)、GR和Nrf2基因表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)；S0低溫組的Cu/Zn-SOD、CAT、GPx-1a、GR和Nrf2基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；S0.5低溫組、S2.0低溫組和S3.0低溫組的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GPx-1b、GR和Nrf2基因表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)；S1.0低溫組的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GR和Nrf2基因表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)。

2.5 小肽對(duì)大黃魚(yú)仔魚(yú)肝臟非特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

由表7可知，與S0常溫組相比，S1.0常溫組的c型溶菌酶(c-type lysozyme，c-typeLZM)、g型蛋白溶菌酶(g-type lysozyme，g-typeLZM)、AKP和NF-κB基因表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P>0.05)；S0低溫組的c-typeLZM、g-typeLZM、AKP和NF-κB基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；S1.0低溫組、S2.0低溫組和S3.0低溫組的c-typeLZM、g-typeLZM、AKP和NF-κB基因表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)；S0.5低溫組的c-typeLZM、AKP和NF-κB基因表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。

表6 小肽對(duì)低溫脅迫下大黃魚(yú)仔魚(yú)肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

表7 小肽對(duì)低溫脅迫下大黃魚(yú)仔魚(yú)肝臟非特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

2.6 相關(guān)性分析

由表8可知，大黃魚(yú)仔魚(yú)ROS含量與Nrf2和NF-κB基因表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Nrf2基因表達(dá)水平與抗氧化酶(Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GPx-1b、GR)基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；NF-κB基因水平與非特異免疫酶(c-typeLZM、g-typeLZM、AKP)基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表8 大黃魚(yú)仔魚(yú)不同參數(shù)之間的相關(guān)性分析

3 討 論

輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)是海水仔魚(yú)育苗的主要活性餌料。然而，它們均存在營(yíng)養(yǎng)缺陷，需要進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化才適合充當(dāng)開(kāi)口餌料。粗蛋白質(zhì)含量、氨基酸種類及其含量是重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。在本研究中，盡管水體中小肽濃度為2.0 mL/m3時(shí)對(duì)輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)的粗蛋白質(zhì)含量未產(chǎn)生顯著影響，但能顯著提高它們的EAA和TAA含量，表明小肽改善了輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)在保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境脅迫所造成的損傷等方面發(fā)揮著積極作用[21]。當(dāng)前，關(guān)于低溫脅迫對(duì)魚(yú)類影響的分子機(jī)理研究?jī)H有少量報(bào)道。有研究表明，飼料中的小肽能夠通過(guò)改善魚(yú)類的抗氧化性能和非特異性免疫力來(lái)提高脅迫耐受性[15-16]。本試驗(yàn)研究了小肽營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)對(duì)大黃魚(yú)仔魚(yú)生長(zhǎng)的影響以及對(duì)低溫脅迫下大黃魚(yú)仔魚(yú)抗氧化性能和非特異性免疫力的影響，并試圖闡明其分子機(jī)理。

與對(duì)照組相比，不同濃度小肽營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)均顯著提高了大黃魚(yú)仔魚(yú)的體長(zhǎng)、小腸絨毛高度和組織面積等生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)，尤其是S1.0組，與李杰[22]的研究結(jié)果相似。小肽通過(guò)增加小腸絨毛高度、數(shù)量和組織面積來(lái)增加小肽載體數(shù)量，從而改善游離氨基酸和小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，進(jìn)而提高魚(yú)類機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成能力和沉淀量，最終促進(jìn)魚(yú)類的生長(zhǎng)[23]。以大黃魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng)為參數(shù)，小肽最佳營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化濃度為1.88 mL/m3。

當(dāng)魚(yú)類處于氧化應(yīng)激生理狀態(tài)時(shí)，機(jī)體內(nèi)通常會(huì)產(chǎn)生大量ROS，因此ROS被認(rèn)為是氧化應(yīng)激標(biāo)志物[24]。S0低溫組的大黃魚(yú)仔魚(yú)ROS含量較S0常溫組顯著提高，表明低溫對(duì)大黃魚(yú)仔魚(yú)產(chǎn)生了氧化損傷。與S0常溫組相比，小肽能夠顯著降低大黃魚(yú)仔魚(yú)機(jī)體內(nèi)的ROS含量，表明其抗氧化能力發(fā)生了改變，從而使機(jī)體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生了新的平衡[5]。與S0低溫組相比，小肽能夠顯著降低低溫脅迫下大黃魚(yú)仔魚(yú)機(jī)體內(nèi)的ROS產(chǎn)量，表明小肽能夠緩解低溫脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。非酶抗氧化劑GSH在抑制超氧化物產(chǎn)生、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[8]。與S0常溫組相比，小肽增加了大黃魚(yú)仔魚(yú)機(jī)體內(nèi)的GSH含量。這進(jìn)一步解釋了小肽能夠提高大黃魚(yú)仔魚(yú)在低溫脅迫下的抗氧化能力，從而降低ROS含量，緩解氧化損傷。

與S0常溫組相比，低溫脅迫(S0低溫組)顯著抑制大黃魚(yú)仔魚(yú)肝臟非特異性免疫酶(c-typeLZM、g-typeLZM和AKP)基因表達(dá)水平，從而降低了非特異性免疫力；而小肽提高了低溫脅迫下大黃魚(yú)仔魚(yú)肝臟c-typeLZM、g-typeLZM和AKP基因表達(dá)水平，從而提高了非特異性免疫力，以此來(lái)應(yīng)對(duì)低溫脅迫誘導(dǎo)的損傷。值得注意的是，在常溫條件下，大黃魚(yú)仔魚(yú)肝臟非特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)水平不受小肽(S1.0常溫組)的影響。有研究表明，功能性食品可改善能量代謝效率來(lái)改變魚(yú)類宿主生理狀態(tài)。一旦遭受脅迫時(shí)，魚(yú)類即可通過(guò)改善免疫功能來(lái)保護(hù)機(jī)體免遭脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷[30]。另外，當(dāng)魚(yú)類處于正常生理狀態(tài)時(shí)，非特異性免疫相關(guān)基因的過(guò)量表達(dá)也會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生負(fù)面影響[31]。

基因表達(dá)水平受核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和NF-κB分別在調(diào)控抗氧化反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12,32]。本研究中，低溫脅迫抑制了大黃魚(yú)仔魚(yú)肝臟Nrf2和NF-κB基因的表達(dá)，這與汞脅迫狀態(tài)下大黃魚(yú)的研究結(jié)果[30-32]相似。Nrf2基因表達(dá)水平與Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GPx-1b、GR基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，表明這些抗氧化酶基因表達(dá)受Nrf2調(diào)控。NF-κB基因表達(dá)水平與c-typeLZM、g-typeLZM和AKP基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，表明這些非特異性免疫酶基因表達(dá)的激活依賴于NF-κB信號(hào)通路。ROS可充當(dāng)抗氧化反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)的第二信號(hào)分子。ROS可激活Nrf2和NF-κB基因表達(dá)，從而調(diào)控抗氧化酶基因和非特異性免疫酶基因的表達(dá)[33-34]。ROS含量與Nrf2和NF-κB基因表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

4 結(jié) 論

① 小肽能夠提高輪蟲(chóng)和鹵蟲(chóng)的必需氨基酸和總氨基酸含量，從而促進(jìn)大黃魚(yú)仔魚(yú)的生長(zhǎng)和小腸發(fā)育，最佳營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化濃度為1.88 mL/m3。

② 小肽通過(guò)誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄基因Nrf2和NF-κB的表達(dá)來(lái)增加抗氧化酶基因和非特異性免疫酶基因表達(dá)水平，從而緩解低溫脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。

致謝：

感謝臺(tái)州大陳黃魚(yú)有限公司陳國(guó)業(yè)工程師對(duì)大黃魚(yú)仔魚(yú)養(yǎng)殖所提供的寶貴意見(jiàn)和技術(shù)指導(dǎo)。