楊甫臣 張世超

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院沈本醫(yī)院骨外科，遼寧本溪 110032

甲狀腺腫是指由多種原因引起的甲狀腺上皮細(xì)胞良性增生導(dǎo)致甲狀腺彌漫性或結(jié)節(jié)性腫大，是臨床上甲狀腺疾病中的常見病。近年來，隨著生活壓力不斷增大，其發(fā)病率不斷升高，且女性多于男性[1]。中藥治療甲狀腺疾病歷史悠久且具有很好的效果?！侗静輦湟穂2]中記載：“海藻，瀉熱、軟堅痰、消癭瘤；昆布，功同海藻而少滑，性雄。治水腫癭瘤。”海藻歸肝、胃、腎經(jīng)，具有軟堅散結(jié)、消痰、利水的作用。昆布?xì)w肝、胃、腎經(jīng)，具有同海藻同樣的功效。臨床上海藻、昆布兩味中藥常相互配伍加減，用于治療甲狀腺類疾病[3-5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門在多向藥理學(xué)理論和系統(tǒng)生物學(xué)理論基礎(chǔ)上分析藥物治療疾病的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，篩選相關(guān)的信號節(jié)點，推測藥物的成分、靶點蛋白、代謝通路等的學(xué)科[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能全面系統(tǒng)地從多角度揭示藥物對疾病的作用機制[7]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，從成分、靶點、通路等多角度探討海藻、昆布治療甲狀腺腫的作用機制，為后續(xù)研究的開展提供新思路與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 海藻、昆布化學(xué)成分及靶點的獲取

為了獲得海藻、昆布兩味中藥的化學(xué)成分，檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp），并以“口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 以及半衰期（HL）≥4 h”作為篩選條件，選取同時滿足以上條件的作為其主要活性成分。TCMSP 數(shù)據(jù)庫包含了500 味中藥，中藥成分化合物總計30 069 個，并針對每個化合物提供了OB、DL、藥物HL 等性質(zhì)評價數(shù)據(jù)[8]。接著，檢索PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到其化學(xué)結(jié)構(gòu)以及Smiles 格式。同時通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swiss-target-prediction.ch/）獲得主要活性成分所對應(yīng)的相關(guān)靶點。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）統(tǒng)一靶點蛋白的名稱，從而得到海藻、昆布兩味中藥的作用靶點。并將其結(jié)果上傳至Cytoscape 軟件，繪制海藻-昆布的主要活性化合物及作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 中藥-甲狀腺腫相關(guān)靶點的搜集與篩選

為了獲得甲狀腺腫的相關(guān)疾病靶點，應(yīng)用Dis GeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）、OMIM（http：//www.omim.org/）及GeneCards（http：//www.genecards.org/）3 個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，合并結(jié)果，去除假陽性和重復(fù)值，得到疾病相關(guān)靶點。將海藻、昆布成分作用靶點和甲狀腺腫相關(guān)的疾病靶點利用R 軟件（https：//cran.r-project.org/mirrors.html）進(jìn)行映射構(gòu)建韋恩圖，篩選出中藥-疾病的共同靶點。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點篩選

應(yīng)用String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）對上述篩選得到的共同靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，其中種類設(shè)為“Homo sapiens”，“highest confidence”＞0.9，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并下載保存TSV 格式文件。同時導(dǎo)入Cytoscape軟件中，基于Network Analyse 功能分析其網(wǎng)絡(luò)。并篩選節(jié)點度值（Degree）分布和介數(shù)中心性（Betweenness centrality）均在中位數(shù)以上的作為“核心靶點”。Degree和Betweenness centrality 是判斷網(wǎng)絡(luò)節(jié)點重要性的拓?fù)鋮?shù)，其值與節(jié)點的重要性成正比。

1.4 GO-BP 生物功能注釋及KEGG 通路分析

利用Metascape 軟件（http：//metascape.org/，version 3.0）對上述得到的核心靶點進(jìn)行GO-BP 生物功能和KEGG Pathway 富集分析，將研究物種設(shè)置為“Homo sapiens”，以此獲得海藻、昆布治療甲狀腺腫的生物學(xué)功能及KEGG 信號通路。將靶點基因、GO-BP 生物功能、KEGG 信號通路導(dǎo)入Cytoscape 軟件，繪制核心靶點-生物功能-信號通路圖。

2 結(jié)果

2.1 海藻-昆布主要活性化合物及靶點的篩選

通過在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索并篩選中藥的活性成分，共收集得到活性化合物海藻4 個、昆布6 個。將其Smiles 格式上傳到Swiss Target Prediction，篩選出作用靶點海藻225 個、昆布145 個。通過匯總兩味中藥的作用靶點并刪除重復(fù)值，最終得到兩味藥共有靶點305 個。應(yīng)用Cytoscape 軟件繪制海藻-昆布的主要活性化合物及作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。

2.2 中藥與甲狀腺腫共同作用靶點

通過檢索DisGeNET、OMIM 及GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得1162 個甲狀腺腫的相關(guān)靶點。將305 個中藥的共有作用靶點與1162 個甲狀腺腫相關(guān)靶點輸入R軟件繪制韋恩圖，取交集后獲得中藥與疾病共同作用靶點70 個。見圖2。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)與核心靶點分析

利用String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建上述共同作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。圖中共有節(jié)點70 個，邊119 條。通過Cytoscape 軟件對網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)（Degree和Betweenness centrality）進(jìn)行分析篩選，即Degree≥4，Betweenness centrality≥3.30×10-3。共得到核心靶點25 個，包括磷脂酰肌醇3-激酶1（PIK3R1）、p53 基因（TP53）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）等。

圖2 中藥與疾病共同作用靶點韋恩圖

2.4 核心靶點生物功能富集分析與KEGG 通路分析

將篩選出的中藥-疾病核心靶點導(dǎo)入Metascape軟件分別進(jìn)行GO-BP 生物學(xué)功能和KEGG 通路富集分析。結(jié)果顯示，海藻、昆布兩味中藥主要通過調(diào)控細(xì)胞蛋白定位、細(xì)胞有絲分裂周期的G1/S 轉(zhuǎn)變、氮化合物的合成、激素刺激和酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)及MAPK級聯(lián)和蛋白激酶B 信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程，以及p53、黏著斑、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、ErbB、VEGF、Jak-STAT 等信號通路發(fā)揮治療甲狀腺腫的作用。見圖4 和圖5。并通過Cytoscape 軟件構(gòu)建核心靶點-生物功能-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。見圖6。

3 討論

中醫(yī)理論中并無甲狀腺腫疾病的概念，根據(jù)主要臨床特征，認(rèn)為其屬于“癭病”范疇。《外科真詮》云：“癭瘤多外因六邪，營衛(wèi)氣血凝郁?！盵9]中醫(yī)認(rèn)為氣滯、痰凝、血瘀結(jié)于頸部是本病的基本病機，多采用理氣化痰、消癭散結(jié)的方法進(jìn)行治療，如海藻玉壺湯、消瘰丸等，其方中均含有海藻、昆布兩味中藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中首次提出應(yīng)用含碘中藥海藻用于治療本病，海藻中含有多糖、脂肪酸等多種活性成分，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次提出應(yīng)用其可治療癭病[10-11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗菌抗炎、抗腫瘤和抗氧化的作用[12-13]。昆布主要活性成分昆布多糖、多酚、蛋白質(zhì)及纖維素等，具有調(diào)血脂、降血糖和血壓、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用[14-16]?！都斡颖静荨分姓撌隼ゲ嫉墓πЭ梢浴叭グ`行水，下氣化痰”。目前臨床研究發(fā)現(xiàn)，海藻、昆布加減治療甲狀腺結(jié)節(jié)具有很好的效果。

圖3 海藻-昆布治療甲狀腺腫的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 海藻-昆布治療甲狀腺腫的GO-BP 生物學(xué)功能

圖5 海藻-昆布治療甲狀腺腫的KEGG 信號通路

本研究篩選得到海藻活性成分包括二甘醇二苯甲酸酯、異巖藻糖甾醇、β-谷甾醇等；昆布活性成分包括24-亞甲基膽甾醇、花生四烯酸、巖藻甾醇等，并得到海藻作用靶點225 個、昆布145 個，與甲狀腺腫靶點取交集后得到共有靶點70 個。通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)以篩選得到25 個核心靶點，包括TP53、PIK3R1、AKT1、APP、TTR 等。p53 基因是一種細(xì)胞生長的重要調(diào)節(jié)因子，具有在DNA 復(fù)制水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生長的功能。沈育鋒等[17]研究發(fā)現(xiàn)，其在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫合并甲狀腺癌患者中的表達(dá)明顯增加，是一種特異性標(biāo)志。PIK3R1、AKT1 是PI3K/AKT 信號通路的重要組成部分，具有調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的作用，同時可以加速細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡。目前多項研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 信號通路在甲狀腺腫病變中異常激活[18-19]。APP 是一種淀粉樣蛋白前體蛋白基因，其與血清三碘甲腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）的表達(dá)密切相關(guān)，在APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，血清T4水平升高，而T3水平下降[20]。而TTR 蛋白主要在肝臟中合成，具有轉(zhuǎn)運甲狀腺素的作用。

GO-BP 生物學(xué)功能富集分析結(jié)果顯示，海藻、昆布兩味中藥主要通過調(diào)控細(xì)胞蛋白定位、細(xì)胞有絲分裂周期的G1/S 轉(zhuǎn)變、氮化合物的合成、激素刺激和酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)以及MAPK 級聯(lián)和蛋白激酶B 信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程發(fā)揮作用。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，其主要通過p53、黏著斑、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號、ErbB、VEGF、Jak-STAT 等信號通路發(fā)揮作用。已有研究表明，甲狀腺激素可通過激活p53、MAPK 等從而調(diào)控其下游基因表達(dá)[21]。VEGF信號通路可調(diào)節(jié)生理性及病理性血管生成過程，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分裂和遷移，促進(jìn)新血管的生成，修復(fù)病變血管內(nèi)膜。VEGF 主要在甲狀腺濾泡細(xì)胞內(nèi)合成。目前多項研究表明，在甲狀腺腫患者的甲狀腺組織及血清中VEGF 均有較高水平的表達(dá)[22-24]。Jak-STAT 信號通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其主要參與介導(dǎo)人體缺氧、缺血以及氧化應(yīng)激等多種應(yīng)激反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，高甲狀腺激素可激活Jak-STAT 信號通路，從而進(jìn)一步發(fā)揮其作用[25-26]。

圖6 海藻-昆布治療甲狀腺腫的核心靶點-GO-BP 生物功能-KEGG 信號通路互作網(wǎng)絡(luò)圖

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法初步闡明了海藻及昆布從多成分、多靶點、多通路治療甲狀腺腫的作用機制，為其今后研究提供思路和依據(jù)。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)的局限性，后期仍需要相應(yīng)的實驗研究加以驗證。