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        三陰性乳腺癌基因拷貝數(shù)變異與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

        2021-03-28 12:41:04李宇翔豐錦春阿孜古麗阿布都熱合曼郁璐月朱麗萍
        關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)染色體生存率

        李宇翔 豐錦春 吳 濤 阿孜古麗·阿布都熱合曼 郁璐月 朱麗萍

        新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科一病區(qū),新疆烏魯木齊 830000

        乳腺癌現(xiàn)居全球女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位[1]。隨著對(duì)乳腺癌在基因水平上探索的深入,為提高其治愈率與生存期提供了基礎(chǔ)[2-3],尤其是對(duì)侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差且異質(zhì)性高的三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的遺傳變異的研究帶來了新的突破[4]。影響TNBC 發(fā)生的相關(guān)危險(xiǎn)因素中,基因拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)與其聯(lián)系相當(dāng)緊密,CNV攜帶者有很高的乳腺癌發(fā)病率[5-7],CNV 亞顯微水平的變化與腫瘤的發(fā)生呈因果關(guān)系[8]。本研究旨在探討CNV 與TNBC 患者臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系,為TNBC 患者預(yù)后研究提供新思路。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱“我院”)2014 年1 月—2016 年1 月資料完整的86 例TNBC 患者為研究對(duì)象,中位年齡56 歲(32~81 歲);根據(jù)中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)2019 年分期標(biāo)準(zhǔn)[9],Ⅰ期5 例,Ⅱ期57 例,Ⅲ期24 例。患者入院后均與院方簽署知情同意書,本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且標(biāo)本均經(jīng)病理診斷、免疫組化及FISH 檢測(cè)驗(yàn)查。納入標(biāo)準(zhǔn):①初次行手術(shù)治療的TNBC;②有完整臨床和隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前接受放化療;②合并其他惡性腫瘤,有惡性腫瘤病史。

        1.2 方法

        全外顯子高通量平行測(cè)序技術(shù)檢測(cè)CNV 情況。從癌組織及癌旁組織中提取DNA 樣品,進(jìn)行基因組DNA 片段化,利用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物芯片分析儀進(jìn)行質(zhì)控。PCR 擴(kuò)增后通過Qubit 2.0 核酸蛋白定量?jī)x對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量。測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)雙端序列比對(duì)到參考序列上,基于比較結(jié)果進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)變異的CNV 情況分析。

        1.3 測(cè)序結(jié)果的判定

        采用Control-FREEC[10]系統(tǒng)檢測(cè)基因組片段的CNV 情況,檢測(cè)結(jié)果中包括:拷貝數(shù)缺失、拷貝數(shù)擴(kuò)增以及拷貝數(shù)正常的雜合性缺失。進(jìn)行CNV 比較時(shí)需要將同一患者癌組織及癌旁組織樣本配對(duì)并進(jìn)行CNV 合并后再行檢測(cè),合并方法是使用CNVRuler[11]工具,最后錄入每對(duì)組織樣本中各條染色體中缺失、擴(kuò)增、雜合性缺失的拷貝數(shù)及拷貝數(shù)總數(shù)。

        1.4 隨訪

        采用定期電話隨訪、門診復(fù)查、入院復(fù)查記錄的方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪,隨訪起始時(shí)間為患者手術(shù)當(dāng)日,終止時(shí)間為死亡,截至2020 年1 月15 日,中位隨訪時(shí)間為38 個(gè)月,所有患者均獲得有效隨訪資料。

        1.5 臨床資料的收集

        收集患者臨床病理資料,包括:①年齡;②TNM分期;③淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況;④原發(fā)腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、Ki67 表達(dá)、月經(jīng)情況;⑤惡性腫瘤家族病史;⑥總生存期、5 年生存率。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。雙變量關(guān)聯(lián)性分析采用Pearson 積矩相關(guān)分析、Spearman 秩相關(guān)分析法,采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析,組間曲線比較采用Log-rank 檢驗(yàn),多因素分析采用Cox 回歸分析法。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 患者CNV 分布情況

        有效測(cè)序數(shù)據(jù)通過bwa-0.7.15[12]系統(tǒng)的SAM 格式比較,樣本經(jīng)配對(duì)合并后共存在5928 個(gè)差異CNV,其中擴(kuò)增41.92%(2485/5928),缺失15.99%(948/5928),正常19.47%(1154/5928),雜合性缺失22.62%(1341/5928)。癌組織(4080 個(gè),68.83%)與癌旁組織(1848 個(gè),31.17%)CNV 分布情況比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.01)。見表1。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組在8 號(hào)染色體上有最頻繁的CNV 擴(kuò)增,無病生存組在17 號(hào)染色體有最頻繁的CNV 丟失及雜合區(qū)域(圖1)。snpEFF[13]軟件對(duì)CNV 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行注釋,樣本中可能存在發(fā)生CNV 的基因型主要有BRCA1/2 基因(在8 號(hào)染色體缺失)、FGFR2 基因(在17 號(hào)染色體缺失)(圖2)。

        圖1 CNV 在染色體上的分布示意圖

        圖2 基因缺失在染色體上的分布

        表1 患者CNV 分布情況比較(個(gè))

        2.2 CNV 與臨床病理特征相關(guān)性分析

        Pearson 相關(guān)性分析顯示,CNV 與年齡、原發(fā)腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈線性相關(guān)(r=-0.87、0.92、0.94,P <0.05)。Spearman 秩相關(guān)分析顯示,CNV 與TNM 分期呈正相關(guān)(r=0.83,P <0.01)。見圖3。

        2.3 生存分析

        至隨訪結(jié)束,86 例中死亡15 例(17.44%),5 年總生存率為82.56%。8 號(hào)染色體發(fā)生CNV 者47 例,5 年生存率為74.4%;無CNV 者5 年生存率為92.3%,兩組5 年生存率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.495,P=0.034)。見圖4。17 號(hào)染色體發(fā)生CNV 者51 例,5 年生存率為74.5%;無CNV 者5 年生存率為94.3%,兩組5 年生存率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.145,P=0.046 )。見圖5。Cox 多因素回歸分析顯示,CNV 情況、TNM 分期是TNBC 患者預(yù)后的影響因素(HR=0.456、1.927,P <0.0 5)。見表2。

        圖3 CNV 與病理特征相關(guān)性分析

        圖4 8 號(hào)染色體CNV 患者5 年生存率比較

        3 討論

        評(píng)估腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),并給予醫(yī)學(xué)干預(yù)改善患者的預(yù)后,是乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。常用的TNM 分期預(yù)后評(píng)價(jià)體系,存在明顯的局限性。分子遺傳學(xué)領(lǐng)域多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),16 號(hào)染色體長(zhǎng)臂(16 q)拷貝數(shù)頻繁丟失發(fā)生于乳腺癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤,16 q拷貝數(shù)全部或部分缺失的乳腺癌惡性程度高于非缺失者,并與預(yù)后存在明顯的相關(guān)性[14]。Svetlana 等[15]研究認(rèn)為CNV 的差異會(huì)影響患者的無病生存期,且存在大量CNV 患者在術(shù)后可能會(huì)較早復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

        圖5 17 號(hào)染色體CNV 患者5 年生存率比較

        表2 三陰性乳腺癌患者Cox 多因素回歸分析

        本研究對(duì)樣本進(jìn)行了CNV 檢測(cè),其中有4691 個(gè)基因在不同組織中存在突變,其原因可能是在腫瘤細(xì)胞減數(shù)分裂過程中,基因組上同一位點(diǎn)的DNA 序列能與其同源序列發(fā)生重組,即等位同源重組。但對(duì)于基因組上的重復(fù)序列,除同一位點(diǎn)上的同源序列外,不同位點(diǎn)上的重復(fù)序列也可能具有高度同源性,發(fā)生非等位的同源重組[16-17]。本研究樣本經(jīng)檢測(cè)在負(fù)荷最高的8 號(hào)、17 號(hào)染色體上存在有BRCA1/2 基因、FGFR2 基因、KRAS 基因等基因的突變類型。癌細(xì)胞分裂后,據(jù)觀察同源重組發(fā)生的位點(diǎn)不是隨機(jī)分布在基因組上的,存在一定的序列傾向性,即重組熱點(diǎn),這可能導(dǎo)致了存在多重組熱點(diǎn)的TNBC 患者會(huì)出現(xiàn)更多的CNV,進(jìn)而影響其臨床病理特征及預(yù)后。

        癌組織樣本中CNV 數(shù)目顯著高于癌旁組織,這可能由于在疾病進(jìn)程中,易復(fù)發(fā)的TNBC 原始癌細(xì)胞突變時(shí)細(xì)胞核異型性更明顯,染色體上多對(duì)等位基因變異,在DNA 復(fù)制過程中存在更多的拷貝數(shù)大片丟失或擴(kuò)增現(xiàn)象,從而帶來更大的負(fù)荷,導(dǎo)致其組織學(xué)分級(jí)更高,發(fā)生淋巴結(jié)及全身轉(zhuǎn)移的更早,對(duì)術(shù)后化療敏感度降低,腫瘤惡性程度高且易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。存在大量CNV 的患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高于較低數(shù)量CNV 的患者,這也提示TNBC 患者發(fā)生大量CNV與其預(yù)后有很高的相關(guān)性。大量研究結(jié)果顯示,TNBC與其他類型乳腺癌的臨床病理特征比較具有更明顯的特征[18-20]。相關(guān)[21-22]研究認(rèn)為TNBC 復(fù)發(fā)及死亡高峰期為術(shù)后5 年內(nèi),并與腫瘤分級(jí)、CNV 情況具有一定的相關(guān)性?;贒NA 重組機(jī)制與DNA 錯(cuò)誤復(fù)制機(jī)制的基因組重排可以產(chǎn)生多種類型的CNV[23],這也就導(dǎo)致了患者臨床病理特征的差異,但是否CNV 種類越多,患者差異越明顯,預(yù)后越差,還需提高CNV分辨率及基因組覆蓋率后進(jìn)一步探討研究。

        Miron 等[24]進(jìn)行的前瞻性臨床試驗(yàn)對(duì)1550 例原發(fā)乳腺癌患者的生存進(jìn)行了分析,其中TNBC 患者5 年總生存率為81.0%,5 年無瘤生存率為84.0%,與本研究患者生存率相似。Zhang 等[25]在拷貝數(shù)改變負(fù)荷導(dǎo)致乳腺癌生存率的差異分析中認(rèn)為,CNV 的攜帶者負(fù)荷最高的是1、8 和16 號(hào)染色體,且與乳腺癌生存率之間存在顯著的關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)8 號(hào)染色體有最頻繁的CNV 擴(kuò)增,17 號(hào)染色體有最頻繁的CNV 丟失及雜合區(qū)域,同時(shí)8、17 號(hào)染色體也是負(fù)荷最高的兩條染色體,這與國(guó)內(nèi)研究結(jié)果存在一定的差異。其原因可能是新疆處于我國(guó)西部邊陲,是一個(gè)多民族聚居的地區(qū)。本研究中納入了包括漢族、維吾爾族、哈薩克族、回族等7 種民族患者樣本,由于民族的差異,在染色體發(fā)生CNV 的過程中,高負(fù)荷染色體結(jié)果可能因樣本多民族種類產(chǎn)生差異,而在負(fù)荷較高的8、17 號(hào)染色體上發(fā)生CNV 的患者5 生存率顯著低于未發(fā)生CNV的患者。因此,目前數(shù)據(jù)支持患者在8、17 號(hào)染色體差異CNV 可能作為TNBC 的預(yù)后指標(biāo),但CNV 導(dǎo)致的染色體變異是否與TNBC 的不良預(yù)后直接相關(guān)仍需要大量的研究,本研究由于樣本量偏小尚不能確切論述CNV 與TNBC 患者預(yù)后的因果關(guān)系,還需要擴(kuò)大樣本量后進(jìn)一步研究。

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