胡安全 馮祁軍 王正安 秦 力 李 哲

浙江省嘉興市第一醫(yī)院骨科，浙江嘉興 314000

周?chē)窠?jīng)損傷多見(jiàn)于高能量暴力損傷患者[1]，尤其以坐骨神經(jīng)損傷最難處理且術(shù)后恢復(fù)緩慢，這與周?chē)窠?jīng)的再生和修復(fù)能力有限、功能恢復(fù)差有關(guān)。目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）已經(jīng)成為組織工程、細(xì)胞治療領(lǐng)域理想的種子細(xì)胞[2-3]，尤其可用于周?chē)窠?jīng)損傷的再生細(xì)胞治療[4]。但是由于干細(xì)胞移植在體內(nèi)的存活率和分化率不理想，患者很難獲得理想的臨床效益[5-7]。為了提高BM-MSCs 移植對(duì)坐骨神經(jīng)損傷的再生與修復(fù)作用，本研究在體外通過(guò)不同的誘導(dǎo)方法定向誘導(dǎo)BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，并進(jìn)一步通過(guò)大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，以證實(shí)在體外定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣BM-MSCs 有促進(jìn)大鼠神經(jīng)損傷恢復(fù)和神經(jīng)遞質(zhì)分泌的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

12 只SPF 級(jí)4 周齡雄性SD 大鼠（175±10）g 和90 只SPF 級(jí)3 月齡雄性SD 大鼠（225±25）g 購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001]，動(dòng)物房溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵循“3R”原則。

BriCyte E6 型流式細(xì)胞儀購(gòu)自深圳邁瑞醫(yī)療公司；β-巰基乙醇（貨號(hào)：0482-250ML）和全反式視黃酸（貨號(hào)：C20734-100mg）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；免疫印跡一抗腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）（貨號(hào)：ab108319）、髓磷脂堿性蛋白（MBP）（貨號(hào)：ab20216）和生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)蛋白43（GAP-43）（貨號(hào)：ab75810）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.2 BM-MSCs 分離培養(yǎng)及鑒定

取12 只4 周齡大鼠，窒息處死。參照Maridas 等[8]、Huang 等[9]方法取大鼠雙側(cè)股骨及脛骨分離骨髓細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)用常規(guī)細(xì)胞貼壁篩選法，通過(guò)多次1∶1傳代在體外進(jìn)行純化。取1.0×106個(gè)/mL P3 代細(xì)胞加入適量鼠抗人抗體CD29、CD44、CD90 免疫熒光鑒定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM-MSCs 表面標(biāo)志物。

1.3 BM-MSCs 定向誘導(dǎo)和分化

將BM-MSCs 細(xì)胞分為化學(xué)誘導(dǎo)分化組（β-巰基乙醇組和全反式視黃酸組）、Transwell 小室共培養(yǎng)組和對(duì)照組（不作處理）。化學(xué)誘導(dǎo)分化組按1.0×105個(gè)/mL濃度接種于蓋玻片上，用低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，達(dá)到70%融合時(shí)，換成含3 mmol/L β-巰基乙醇或1 μmol/L 全反式視黃酸的培養(yǎng)基誘導(dǎo)。Transwell 小室共培養(yǎng)組，取細(xì)胞懸液，培養(yǎng)貼壁細(xì)胞至有神經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)后，按1×106個(gè)/mL 的密度接種于Transwell 雙層培養(yǎng)皿的底層，Transwell 內(nèi)板中接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

誘導(dǎo)7 d 后，免疫組化法檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)。并用細(xì)胞免疫熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)法鑒定神經(jīng)分化標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素（NT3）、微管相關(guān)蛋白2（MAP2）、Tau、趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 受體（CXCR4）、神經(jīng)微絲蛋白200 kD（N200）、NESTIN、泛素（UBIQUITIN）、微管蛋白Ⅲ（TUBULIN Ⅲ）陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.4 大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型的建立和分組

取90 只3 月齡SD 大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、普通細(xì)胞組與定向誘導(dǎo)組。除假手術(shù)組20 只外，其余70 只大鼠用鉗夾法建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型[10]。操作方法：腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定。常規(guī)備皮、消毒后，鈍性分離左大腿肌肉。顯露坐骨神經(jīng)，在大腿根部用動(dòng)脈瘤夾鉗夾坐骨神經(jīng)，鉗夾10 s，反復(fù)3 次，造成3 mm 的損傷區(qū)。手術(shù)過(guò)程中，顯微鏡觀察到其外膜連續(xù)而神經(jīng)軸突中斷。含抗生素鹽水清潔傷口后，縫合組織。術(shù)后，以大鼠左下肢反應(yīng)遲鈍，屈伸力量明顯減弱，為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)，而不用夾鉗損傷神經(jīng)，隨后縫合組織。最終造模成功63 只，為了平衡每組動(dòng)物數(shù)量，隨機(jī)剔除3 只大鼠，確保每組20 只大鼠。術(shù)后用微量注射器將10 μL 的P3 代BM-MSCs 懸液（1×106個(gè)）和經(jīng)定向誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞懸液（1×106個(gè)）分別植入普通細(xì)胞組和定向誘導(dǎo)組大鼠坐骨神經(jīng)損傷處。假手術(shù)組和模型組注入等量生理鹽水。注射3 min，留針5 min。注射完成后，繼續(xù)飼養(yǎng)12 周。

1.5 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）評(píng)估

自制大鼠足跡行走箱，采集四組2、4、8、12 周（細(xì)胞移植后）大鼠足印，根據(jù)Bain 公式[11]計(jì)算并比較各組大鼠的SFI。SFI 測(cè)定結(jié)果介于-100（完全失去神經(jīng)支配功能）～0（運(yùn)動(dòng)正常）。

1.6 大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估

采用Basso Beattie Bresnahan（BBB）運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分法評(píng)估大鼠運(yùn)動(dòng)功能，自大鼠造模后2、4、8、12 周（細(xì)胞移植后）對(duì)大鼠模型進(jìn)行盲法評(píng)分。BBB 分值介于0（完全失去神經(jīng)支配功能）～21 分（運(yùn)動(dòng)正常）[12]。

1.7 肌濕重恢復(fù)率比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)（E）和健側(cè)（N）小腿三頭肌稱重，根據(jù)公式[13]（肌濕重恢復(fù)率=E 肌濕重/N肌濕重×100%）計(jì)算肌濕重恢復(fù)率。

1.8 大鼠坐骨神經(jīng)中BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

BBB 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分后，通入過(guò)量二氧化碳，將大鼠安樂(lè)死。收集大鼠坐骨神經(jīng)組織，提取總蛋白。經(jīng)BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，加入適量樣品緩沖液調(diào)節(jié)蛋白濃度為0.5 μg/μL，100℃水浴5 min 后，SDS-PAGE膠上每孔上樣20 μL。120 V 40 min 后轉(zhuǎn)膜7 min。至5%的脫脂奶粉中封閉30 min。加入相應(yīng)的一抗（1:1000）稀釋液，4℃儲(chǔ)存，過(guò)夜；加HRP 標(biāo)記二抗（1:1000），水平搖床，室溫封閉1 h 后，TBST 洗3 次，每次10 min，顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BM-MSCs 形態(tài)變化及鑒定

大鼠BM-MSCs 培養(yǎng)24 h 后，只有少數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；貼壁細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)72 h 后開(kāi)始增殖，逐漸出現(xiàn)出現(xiàn)長(zhǎng)短不一的突起，并呈集落樣生長(zhǎng)。P3 代細(xì)胞生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)均一，排列緊密，呈渦旋狀集落，見(jiàn)圖1。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，P3 代BM-MSCs 可高表達(dá)CD29、CD44、CD90，幾乎不表達(dá)CD45，見(jiàn)圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察BM-MSCs 細(xì)胞形態(tài)（100×）

2.2 不同誘導(dǎo)方法對(duì)BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率的影響

整體比較：不同誘導(dǎo)方法對(duì)BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率組間、時(shí)間及交互作用比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。組內(nèi)比較：對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。β-巰基乙醇組、全反式視黃酸組、Transwell 小室共培養(yǎng)組各時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。組間比較：第1 天，Transwell 小室共培養(yǎng)組BM-MSCs神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率高于β-巰基乙醇組、全反式視黃酸組；全反式視黃酸組BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率低于β-巰基乙醇組；β-巰基乙醇組BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組。第3、5、7 天，四組各時(shí)間點(diǎn)組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見(jiàn)表1。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3 代BM-MSCs 細(xì)胞表面抗原

誘導(dǎo)7 d 后，β-巰基乙醇組BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率高于其他三組，故而選擇β-巰基乙醇組定向誘導(dǎo)分化7 d 后的BM-MSCs 用于后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

表1 不同誘導(dǎo)方法對(duì)BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率的影響（%，，n=3）

表1 不同誘導(dǎo)方法對(duì)BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率的影響（%，，n=3）

注：與同組第1 天比較，*P <0.05；與同組第3 天比較，#P <0.05；與同組第5 天比較，&P <0.05；與對(duì)照組同期比較，aP <0.05；與β-巰基乙醇組同期比較，bP <0.05；與全反式視黃酸組同期比較，cP <0.05。BM-MSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

2.3 β-巰基乙醇定向誘導(dǎo)分化7 d 后的BM-MSCs神經(jīng)分化標(biāo)志物檢測(cè)

免疫熒光染色法顯示，神經(jīng)分化標(biāo)志物CXCR4、GFAP、NT3、MAP2、Tau、N200 表達(dá)率為75%～100%，NESTIN 陽(yáng)性表達(dá)率為50%～75%，而UBIQUITIN、TUBULIN Ⅲ檢出率為25%～50%，見(jiàn)圖3。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)法顯示，GFAP、NT3、MAP2、Tau、N200陽(yáng)性表達(dá)率超過(guò)70%，CXCR4、NESTIN、UBIQUITIN、TUBULIN Ⅲ細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率低于70%，見(jiàn)圖4。

圖3 免疫熒光染色法檢測(cè)β-巰基乙醇定向誘導(dǎo)分化7 d 后BM-MSCs 神經(jīng)分化標(biāo)志物（10 000×）

2.4 四組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 比較

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)β-巰基乙醇定向誘導(dǎo)分化7 d 后BM-MSCs 神經(jīng)分化標(biāo)志物

整體比較：各組大鼠SFI 組間、時(shí)間及交互作用比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。組內(nèi)比較：假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)SFI 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；模型組、普通細(xì)胞組、定向誘導(dǎo)組各時(shí)間點(diǎn)SFI比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。組間比較：模型組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。定向誘導(dǎo)組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 高于模型組、普通細(xì)胞組；普通細(xì)胞組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見(jiàn)表2～3。

表2 假手術(shù)組和模型組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 比較（%，，n=20）

表2 假手術(shù)組和模型組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 比較（%，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P <0.05；與假手術(shù)組同期比較，aP <0.05。SFI：坐骨神經(jīng)功能指數(shù)

表3 模型組、普通細(xì)胞組、定向誘導(dǎo)組大鼠在術(shù)后2、4、8、12 周SFI 結(jié)果（%，，n=20）

表3 模型組、普通細(xì)胞組、定向誘導(dǎo)組大鼠在術(shù)后2、4、8、12 周SFI 結(jié)果（%，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P <0.05；與模型組同期比較，bP <0.05；與普通細(xì)胞組同期比較，cP <0.05。SFI：坐骨神經(jīng)功能指數(shù)

2.5 四組術(shù)后2、4、8、12 周BBB 評(píng)分比較

整體比較：各組大鼠BBB 評(píng)分組間、時(shí)間及交互作用比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。組內(nèi)比較：四組術(shù)后8 周、12 周BBB 評(píng)分高于術(shù)后2 周和4 周，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；四組術(shù)后2 周和4 周BBB 評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。組間比較：模型組術(shù)后2、4、8、12 周BBB 評(píng)分低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。定向誘導(dǎo)組術(shù)后8、12 周BBB 評(píng)分高于模型組和普通細(xì)胞組；普通細(xì)胞組術(shù)后8、12 周BBB 評(píng)分高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見(jiàn)表4～5。

2.6 四組肌濕重恢復(fù)率比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組大鼠肌濕重恢復(fù)率為（42.50±2.17）%，低于假手術(shù)組的（92.58±4.57）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。定向誘導(dǎo)組肌濕重恢復(fù)率為（65.78±3.36）%，高于普通細(xì)胞組的（52.45±3.34）%及模型組；普通細(xì)胞組肌濕重恢復(fù)率高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

表4 假手術(shù)組和模型大鼠術(shù)后2、4、8、12 周BBB 評(píng)分結(jié)果（分，，n=20）

表4 假手術(shù)組和模型大鼠術(shù)后2、4、8、12 周BBB 評(píng)分結(jié)果（分，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P<0.05；與假手術(shù)組同期比較，aP<0.05。BBB：Bsso Beattie Bresnahan

表5 模型組、普通細(xì)胞組、定向誘導(dǎo)組大鼠術(shù)后BBB 評(píng)分結(jié)果（分，，n=20）

表5 模型組、普通細(xì)胞組、定向誘導(dǎo)組大鼠術(shù)后BBB 評(píng)分結(jié)果（分，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P <0.05；與模型組同期比較，bP <0.05；與普通細(xì)胞組同期比較，cP <0.05。BBB：Bsso Beattie Bresnahan

2.7 四組BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達(dá)比較

模型組BDNF、MBP 與和GAP-43 蛋白表達(dá)量低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。定向誘導(dǎo)組BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達(dá)量高于模型組和普通細(xì)胞組；普通細(xì)胞組BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達(dá)量高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見(jiàn)圖5、表6。

圖5 Western blot 法檢測(cè)各組BDNF、MBP和GAP-43 蛋白表達(dá)差異

表6 Western blot 法檢測(cè)各組BDNF、MBP和GAP-43 蛋白表達(dá)量（，n=20）

表6 Western blot 法檢測(cè)各組BDNF、MBP和GAP-43 蛋白表達(dá)量（，n=20）

注：與假手術(shù)組，aP <0.05；與模型組，bP <0.05；與普通細(xì)胞組，cP <0.05。BDNF：腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；MBP：髓磷脂堿性蛋白；GAP-43：生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)蛋白43

3 討論

BM-MSCs 因其來(lái)源方便，能實(shí)現(xiàn)體外增殖和培養(yǎng)，同時(shí)又具有多向分化潛能，并且避免了倫理沖突[14]，在臨床上具有很大的疾病治療潛力。其主要作用機(jī)制在于通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌，直接促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，與靶細(xì)胞重新建立聯(lián)系；或間接誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)[15]；此外BM-MSCs也具備橫向分化潛能，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)作用下，少部分BM-MSCs 在體內(nèi)可分化為神經(jīng)外胚層樣細(xì)胞，但是仍有大部分BM-MSCs 分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞[16]。因此在應(yīng)用BM-MSCs 時(shí)，體外成功將其定向分化的技術(shù)至關(guān)重要，這在很大程度上影響疾病的治療效果。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要采用化學(xué)誘導(dǎo)法（β-巰基乙醇、全反式視黃酸）和Transwell 小室共培養(yǎng)法將BMMSCs在體外定向誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞[17]。本研究利用β-巰基乙醇，全反式視黃酸和Transwell 小室共培養(yǎng)3 種誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)7 d 后，各組BM-MSCs逐漸向典型神經(jīng)元的形態(tài)特征發(fā)生變化，提示3 種誘導(dǎo)方式都可以成功誘導(dǎo)BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，形成軸突和樹(shù)突。但是通過(guò)免疫組化法檢測(cè)不同誘導(dǎo)條件下神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率發(fā)現(xiàn)，β-巰基乙醇誘導(dǎo)分化組神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性表達(dá)率高于其他三組（P<0.05），故而選擇β-巰基乙醇定向誘導(dǎo)分化7 d 后的BM-MSCs 用于后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

全反式視黃酸是維生素A 的主要活性代謝產(chǎn)物[18]。本研究結(jié)果顯示，在3 種誘導(dǎo)方法下，全反式視黃酸誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元所占比例最低，與其在大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化作用中類(lèi)似[19-20]。全反式視黃酸誘導(dǎo)分化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用原理可能與激活BMP 信號(hào)通路有關(guān)。其通過(guò)上調(diào)負(fù)責(zé)成脂分化的BMP 受體IA 的表達(dá)，從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂化，所以降低了向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化[21]。Transwell 小室共培養(yǎng)法是通過(guò)細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞之間的相互接觸、相互支持的特異空間結(jié)構(gòu)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。本研究中，Transwell 小室共培養(yǎng)法誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元比例較高，這可能是因?yàn)楣才囵B(yǎng)中神經(jīng)細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子[22]、神經(jīng)遞質(zhì)[23]等促進(jìn)了BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化。共培養(yǎng)法的機(jī)制使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞置于一種更接近人體的微環(huán)境中，誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞分化。β-巰基乙醇是研究較早且較為成熟的一種分化誘導(dǎo)劑，通過(guò)提高胞質(zhì)內(nèi)抗氧化成分-谷胱甘肽的水平降低氧自由基的生成量以達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞分化的目的[24]。關(guān)寧等[25]研究顯示，β-巰基乙醇組神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性率和微管相關(guān)蛋白分化率更高，說(shuō)明相較于神經(jīng)生長(zhǎng)因子，β-巰基乙醇能夠更好地促進(jìn)BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。本研究結(jié)果顯示，β-巰基乙醇通過(guò)提高神經(jīng)分化標(biāo)志物GFAP、NT3、MAP2、Tau、CXCR4、N200、NESTIN、UBIQUITIN、TUBULIN Ⅲ等特異性蛋白的表達(dá)量，刺激胞體和樹(shù)突發(fā)育，提高神經(jīng)元存活數(shù)量，與鄰近的細(xì)胞間形成突觸連接，進(jìn)而形成穩(wěn)定的神經(jīng)元細(xì)胞。

此外本研究進(jìn)一步通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，普通細(xì)胞組和定向誘導(dǎo)組大鼠運(yùn)動(dòng)功能較模型組大鼠明顯改善，無(wú)論是注射BM-MSCs 還是注射神經(jīng)元樣向誘導(dǎo)分化的BM-MSCs，都具有恢復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)電生理學(xué)特性和拉伸力學(xué)性能的作用。而且坐骨神經(jīng)損傷處神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)因子（BDNF、MBP、GAP-43 蛋白）的表達(dá)水平明顯升高。定向誘導(dǎo)組大鼠SFI 指數(shù)、BBB 評(píng)分、肌濕重恢復(fù)率高于普通細(xì)胞組（均P<0.05），提示BM-MSCs 可以向神經(jīng)損傷點(diǎn)傳遞有助于功能恢復(fù)的關(guān)鍵信號(hào)，進(jìn)而改變細(xì)胞行為或轉(zhuǎn)移某些細(xì)胞因子以減輕損傷。而且神經(jīng)元樣定向誘導(dǎo)分化的BM-MSCs更有利于坐骨神經(jīng)損傷的恢復(fù)。

綜上，β-巰基乙醇可定向誘導(dǎo)BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，能夠獲得穩(wěn)定的神經(jīng)元細(xì)胞。在坐骨神經(jīng)損傷處注射定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的BMMSCs 具有明顯的神經(jīng)損傷修復(fù)作用，可促進(jìn)神經(jīng)元再生。從而證實(shí)利用成體干細(xì)胞（大鼠BM-MSCs）誘導(dǎo)神經(jīng)元樣定向分化作為一種簡(jiǎn)便的治療方法用于周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)疾病的可能性。