劉青川 曹文斌 楊新波 王仁杰 王蒙蒙 黃正明

北京衛(wèi)健基業(yè)生物技術研究所藥理室，北京 100039

新型冠狀病毒肺炎疫情的暴發(fā)導致世界經(jīng)濟遭受巨大損失，人民健康受到嚴重威脅。2020 年2 月11 日，新型冠狀病毒所致的疾病被WHO 正式命名為“2019 冠狀病毒疾病”（coronavirus disease 2019，COVID-19）[1]；新型冠狀病毒被正式命名為嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。截至2020 年9 月11 日，我國已累計報告確診病例85 174 例，累計死亡病例4634 例[2]。海外疫情則更為嚴重，感染和死亡人數(shù)仍處于快速增長之勢，疫情形勢不容樂觀。此次疫情中，中醫(yī)藥學結合了對“疫”病的治療手段，在COVID-19 的預防和治療中發(fā)揮了重要作用。中藥水芹自《本草求真》《神農(nóng)本草》《本草綱目》等古籍就有記載，具有清熱解毒功能，主治黃病、小兒暴熱等證。近代研究發(fā)現(xiàn)，水芹中含有豐富的黃酮類和酚酸類物質(zhì)，這些活性成分對乙型肝炎和艾滋病等病毒感染性疾病具有良好的治療作用，體內(nèi)外實驗結果均表明其可顯著抑制病毒復制[3-4]；其作用機制與影響病毒DNA 聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的活性密切相關[5-6]。基于水芹抗病毒作用的研究，本研究運用網(wǎng)絡藥理學手段，研究水芹的作用靶標和信號通路，預測和分析其防治COVID-19 的可能性和潛在分子機制，為水芹治療COVID-19 的實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫

TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Pre diction（http://www.swisstargetprediction.ch/）；UniProt（http://www.uniprot.org/）；疾病靶點數(shù)據(jù)庫：TTD（http://db.idrblab.net/ttd），OMIM（https://www.omim.org/），Drugbank（https://www.drugbank.ca/），GeneCards（http://www.genecards.org）；STRING（https://string-db.org）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）。

1.2 獲取水芹活性成分靶點

通過北京衛(wèi)健基業(yè)生物技術研究所研究和文獻查詢[7-9]，選取水芹的7 種活性成分：綠原酸、咖啡酸、蘆丁、山奈酚、槲皮素、異鼠李素、金絲桃苷。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取各活性成分的靶點。用PubChem獲取各成分化學結構并導入Swiss Target Prediction中，預測各成分相關靶點。將兩個數(shù)據(jù)庫檢索結果篩選合并，得到活性成分潛在靶點。

1.3 疾病靶點獲取

4 個疾病靶點數(shù)據(jù)庫以“COVID-19”“novel coronavirus pneumonia”“SARS-COV-2”進行檢索，將檢索結果合并，去除重復，得到COVID-19 相關疾病靶點。

1.4 獲取活性成分-疾病共有靶點

將活性成分靶點和COVID-19 的疾病靶點取交集，獲得活性成分-疾病共有靶點。

1.5 構建水芹活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

將共有靶點輸入STRING，限定種屬“Homo sapiens”，設置最低置信度0.4，得到活性成分-靶點的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡。將得到的STRING 文件導入Cytoscape 3.7.2 軟件，制作PPI 可視化圖，分析水芹對COVID-19 的關鍵靶點。

1.6 活性成分-靶點網(wǎng)絡的構建

將水芹活性成分和關鍵靶點導入Cytoscape，構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖。

1.7 GO 和KEGG 富集分析

將活性成分-疾病共有靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫，獲得基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析數(shù)據(jù)。GO 分析包含分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）、細胞學組分（cellular components，CC）三部分。分別選取GO、KEGG 前10 條主要信息，用R Studio 對數(shù)據(jù)進行分析和計算，繪制氣泡圖。

1.8 構建“靶點-信號通路”網(wǎng)絡圖

將KEGG 富集分析結果和相關靶點導入Cytoscape 軟件，制作“靶點-信號通路”網(wǎng)絡圖。

2 結果

2.1 水芹活性成分和靶點預測

水芹的7 種活性成分中有部分成分已報道與COVID-19 治療密切相關[10]，故部分成分沒有按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、化合物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 進行篩選。分析得到水芹各成分靶點數(shù)見表1，所有靶點經(jīng)合并篩選后共有306 個。

表1 水芹中活性成分信息和潛在靶點

2.2 水芹防治COVID-19 疾病靶點的篩選

通過檢索4 個疾病靶點數(shù)據(jù)庫，篩選去重，獲得COVID-19 相關靶點355 個，用UniProt 進行轉(zhuǎn)化。將水芹活性成分靶點與COVID-19 靶點相互交集，得到活性成分-疾病靶點共60 個。見表2。

2.3 活性成分-靶點PPI 網(wǎng)絡

通過STRING 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 制作PPI 可視化網(wǎng)絡圖，結果顯示，網(wǎng)絡中有60 個節(jié)點，778 條連接邊，節(jié)點的顏色深淺和形狀大小與度值呈正比，分析得到20 個核心基因，其中TNF、IL-6、MAPK1、CASP3等為水芹活性成分與COVID-19 相關的關鍵靶點。見圖1。

表2 活性成分-疾病共有靶點信息

2.4 活性成分-靶點網(wǎng)絡分析

采用Cytoscape 進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)絡中共67 個節(jié)點（含活性成分和靶點），共110 條邊，其中重要靶點為TNF、IL-6、MAPK1、CASP3 等。見圖2。

圖1 活性成分-靶點的蛋白-蛋白相互作用可視化網(wǎng)絡圖

圖2 活性成分-靶點網(wǎng)絡

2.5 GO 和KEGG 通路富集分析

采用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 分析，得到497 個條目，分別選取排名前10 條目，繪制氣泡圖，見圖3。BP 涉及炎癥反應、細胞凋亡、免疫應答等；MF 涉及蛋白質(zhì)結合、酶結合、細胞因子活性等；CC 涉及細胞質(zhì)、質(zhì)膜、細胞核、線粒體等。提示水芹活性成分可以通過調(diào)控多種生物學途徑防治COVID-19。

圖3 GO 富集分析氣泡圖

KEGG 通路富集分析獲得116 條信號通路。選取排名前10 條目，繪制氣泡圖，見圖4，其中密切相關的通路主要有TNF、Toll 樣受體信號通路等。提示水芹防治COVID-19 的作用多樣性。

圖4 KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.6 “靶點-信號通路”網(wǎng)絡

選取前10 條KEGG 通路，將每個通路的靶點合并去重，得到43 個靶點。用Cytoscape 建立“靶點-通路”網(wǎng)絡圖，拓撲學分析發(fā)現(xiàn)，圖中共53 個節(jié)點（靶點43 個、通路10 個）、192 條連接線，網(wǎng)絡密度為0.139，網(wǎng)絡異質(zhì)性為0.889，其中最為密切的是TNF 及其信號通路、Toll 樣受體信號通路，在COVID-19 中發(fā)揮著重要作用。見圖5。

3 討論

圖5 “靶點-信號通路”網(wǎng)絡圖

網(wǎng)絡藥理學是Hopkins[11]于2007 年提出的概念，依靠數(shù)據(jù)庫信息和計算機的輔助，對藥物治療疾病的作用靶點和通路進行初步預測[12]。SARS-CoV-2 具有傳染性強、潛伏期長、偽裝性強、攻擊免疫系統(tǒng)、感染者無癥狀等特點[13]，加大了COVID-19 科研工作的風險和難度。自疫情暴發(fā)以來，以網(wǎng)絡藥理學為手段對中藥防治COVID-19 的研究大量涌出，該方法為中藥治療COVID-19 提供了理論基礎，拓展中藥研究新的研究思路，促進中藥現(xiàn)代化的進展[14]。

SARS-CoV-2 感染過程中會過度激活宿主免疫應答，釋放細胞因子和趨化因子，引發(fā)“細胞因子風暴”，造成肺部器官病變[15-16]。中藥對COVID-19 的治療主要通過解熱、抗感染、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多途徑，緩解細胞因子風暴，達到治療作用[17-19]。細胞因子風暴中，TNF 可促進炎癥反應，調(diào)控細胞的增殖、存活、分化和凋亡[20]。TNF 信號通路里MAPK、NF-κB 信號通路的激活可導致促炎基因表達，誘導細胞凋亡和造成組織損傷[21]。水芹中蘆丁、槲皮素、山奈酚、金絲桃苷均參與TNF 信號通路的調(diào)控，可能通過下調(diào)NF-κB 信號轉(zhuǎn)導通路或MAPK 信號通路的活化，降低TNF-α、IL-6、CAPS3 等因子的釋放，緩解免疫反應，降低肺炎癥程度[22-23]。Toll 樣受體是固有免疫病原模式識別受體，可識別激活天然免疫系統(tǒng)來抵抗病原微生物的入侵。Toll 樣受體通路中也有NF-κB、MAPK信號通路的參與，且NF-κB 是其下游樞紐，參與炎癥調(diào)節(jié)、免疫反應等[24]。水芹上述成分也可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體通路、阻止NF-κB 磷酸化釋放進入細胞核，調(diào)控TNF-α、IL-6、IL-1β 等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，減輕炎癥癥狀。有報道顯示，綠原酸也可以通過抑制機體的NF-κB 活化，促進病原體侵染細胞的凋亡[25]。此外，蘆丁、金絲桃苷與新冠病毒的主要蛋白酶可通過非極性相互作用結合，抑制蛋白酶的活性，達到抗病毒效果[10]。

本研究以網(wǎng)絡藥理學方法，對水芹治療COVID-19的可能機制進行預測和分析，發(fā)現(xiàn)水芹可參與TNF和Toll 樣受體通路的調(diào)控，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生。水芹中活性物質(zhì)不僅限于本研究中的成分，其有效部位水芹總酚酸含量達到50%以上，除含上述成分外，尚有未明確的成分有待研究。如將水芹系統(tǒng)全面地論證，僅用網(wǎng)絡藥理學的方法是有缺陷和不足的，本研究結果可為水芹后期的實驗研究指引方向和提供理論基礎。