黃為琰,張文清,鄭詩(shī)豪

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福建 福州,350122;2.福建省立醫(yī)院 神經(jīng)外科,福建 福州,350001)

脊髓損傷是神經(jīng)外科一類重癥疾病，可分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性脊髓損傷，前者較為常見(jiàn)，常由外部物理因素引起[1],后者常由腫瘤、缺血或先天性疾病引起[2]。脊髓損傷通過(guò)神經(jīng)元損害、肌肉廢用等途徑引起骨骼肌萎縮[3-4]。目前已有學(xué)者對(duì)脊髓組織損傷后繼發(fā)的線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激激活、肌肉蛋白質(zhì)合成與降解等過(guò)程進(jìn)行了相關(guān)研究[5-6],但其病理、生理的復(fù)雜性限制了該病的治療進(jìn)展。本研究對(duì)脊髓損傷后肌肉萎縮患者的肌肉組織進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并探討該病的發(fā)病機(jī)制，以期為潛在治療方法提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 基因芯片的篩選

選擇GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)檢測(cè)，編號(hào)為GSE21497的芯片進(jìn)行分析。此芯片從招募的10位脊髓損傷肌肉萎縮的患者中獲取骨骼肌樣本，其中包括脊髓損傷患者男9例和女1例(6例為四肢癱瘓,4例為截癱)，平均年齡 44歲。入選標(biāo)準(zhǔn):18歲以上患者;格拉斯哥昏迷評(píng)分大于 13分者;無(wú)肌肉擠壓傷、低氧損傷、系統(tǒng)性敗血癥、全身性炎癥者;自身免疫性疾病及惡性腫瘤者。分別在脊髓損傷后第2、5天使用5mm Berstrom活檢針從10位患者的股外側(cè)肌獲取肌肉樣本，取下后立即置入液氮中凍存，儲(chǔ)存于-80℃待測(cè)。以患者第2天的股外側(cè)肌樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)為對(duì)照組，以第5天樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)作為實(shí)驗(yàn)組。

1.2 芯片數(shù)據(jù)處理與差異基因提取

使用R軟件中affyPLM、RColorBrewer包進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)分析，得出相對(duì)對(duì)數(shù)表達(dá)圖，觀察各組樣本數(shù)據(jù)表達(dá)強(qiáng)度。然后調(diào)用R軟件中affyPLM、affy包通過(guò)RMA算法對(duì)芯片進(jìn)行背景校正。利用R軟件中l(wèi)imma包，設(shè)置差異基因篩選條件:logFC>1或logFC<(-1),且adj.P.val<0.05。將提取的差異基因?qū)隣micShare(https://www.omicshare.com/)在線網(wǎng)站制作出火山圖、熱圖。

1.3 差異基因富集分析

將篩選出的差異基因?qū)隡etascape在線網(wǎng)站，進(jìn)行GO分析、KEGG信號(hào)通路分析，以柱狀圖表現(xiàn)富集結(jié)果，獲取基因相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的差異基因?qū)隡etascape在線網(wǎng)站，進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。利用MCODE算法檢測(cè)出相互作用結(jié)果緊密的蛋白質(zhì)模塊中的關(guān)鍵差異基因。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓損傷后肌肉萎縮患者肌肉組織中的差異基因

使用R軟件得出相對(duì)對(duì)數(shù)表達(dá)圖，每個(gè)樣品的中心均較接近縱坐標(biāo)0,結(jié)果表明樣本平行試驗(yàn)一致性較強(qiáng)，見(jiàn)圖1A。樣本背景校正后，設(shè)置差異倍數(shù)大于2及校正后P值小于0.05,篩選出294個(gè)差異基因。2組樣本中共有8個(gè)上調(diào)表達(dá)差異基因,286個(gè)下調(diào)表達(dá)差異基因，見(jiàn)表1。將差異基因?qū)隣micShare在線網(wǎng)站制作熱圖和火山圖，見(jiàn)圖1B、圖1C。

表1 脊髓損傷肌肉萎縮患者第2、5天肌肉樣本的差異基因

2.2 差異基因的GO、KEGG分析

GO富集中,CC中差異基因主要集中于肌纖維組分、肌質(zhì)、異構(gòu)SMAD蛋白復(fù)合體、肌球蛋白復(fù)合物、肌膜、細(xì)胞器外膜。分子MF中差異基因主要集中于肌肉的結(jié)構(gòu)組分、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、生長(zhǎng)因子結(jié)合、整聯(lián)蛋白結(jié)合、碳水化合物結(jié)合、β-連環(huán)蛋白結(jié)合、熱休克蛋白結(jié)合、碳酸脫水酶活性、脂肪酸連接酶活性、陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。BP中差異基因主要集中于肌肉器官發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞衰亡的正向調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化的負(fù)向調(diào)控、能量平衡、脂肪細(xì)胞分化、細(xì)胞對(duì)外部刺激的反應(yīng)、對(duì)氮化合物的反應(yīng)、對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、輔因子生物合成、突觸修剪等。見(jiàn)圖2。

KEGG信號(hào)通路主要包括:補(bǔ)體系統(tǒng)信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、黏著斑信號(hào)通路、氮素代謝信號(hào)通路、精氨酸和脯氨酸代謝信號(hào)通路、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝信號(hào)通路、鐵死亡信號(hào)代謝通路、煙酸和煙酰胺代謝信號(hào)通路、半乳糖代謝信號(hào)通路等。

2.3 蛋白質(zhì)相互作用分析及關(guān)鍵差異基因獲取

蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)中,4個(gè)蛋白相互作用較豐富模塊中的關(guān)鍵基因共有18個(gè):TNNI1、TNNC1、TCAP、ACTN2、MYL3、MYL2、DNAJA4、DNAJB5、GYS1、UGP2、AKR1B10、GOT1、C1QA、C1QB、C1QC、CASQ2、DAXX、SLC2A4,見(jiàn)圖3。

3 討 論

脊髓損傷導(dǎo)致肌肉萎縮，亦使全身多系統(tǒng)繼發(fā)嚴(yán)重功能障礙[6]。研究[7-8]表明，在脊髓損傷后6周內(nèi)，骨骼肌平均橫截面積比對(duì)照組低18%～46%,且身體總脂肪率增高。肌肉萎縮可加重胰島素抵抗并促進(jìn)糖尿病發(fā)展[9],同時(shí)下肢肌肉收縮力量減弱，引起循環(huán)血量不足，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)耐力降低、呼吸功能減弱等[10-11]。目前對(duì)于該病的研究仍以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑橹?，本研究選擇GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為GSE21497的患者骨骼肌樣本進(jìn)行研究，更具客觀意義。

通過(guò)分析篩選出294個(gè)差異基因，經(jīng)GO分析富集于CC中的差異基因主要存在于肌質(zhì)、肌膜、肌球蛋白復(fù)合物中;MF中差異基因主要參與肌肉構(gòu)成以及β-連環(huán)蛋白、熱休克蛋白等物質(zhì)的結(jié)合過(guò)程;BP中差異基因主要參與肌肉發(fā)育、突觸修剪、活性氧代謝等過(guò)程。研究[5]發(fā)現(xiàn)，肌肉蛋白質(zhì)的合成和降解失衡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬等過(guò)程在該病的進(jìn)程中起重要作用。CHEN Z等[12]發(fā)現(xiàn)，損傷的肌肉組織中FoxM1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量下降，引起Wnt通路中β-連環(huán)蛋白信號(hào)過(guò)度激活，導(dǎo)致肌肉萎縮和再生不良。通過(guò)促進(jìn)FoxM1轉(zhuǎn)錄可顯著上調(diào)肌肉干細(xì)胞中Apc的表達(dá)，降低β-連環(huán)蛋白水平，拮抗肌肉損傷。CRISTOFANI R等[13]發(fā)現(xiàn)，小熱休克蛋白B8分子通過(guò)介導(dǎo)錯(cuò)誤折疊蛋白的自噬可緩解肌肉萎縮。

KEGG信號(hào)通路中差異基因主要集中在補(bǔ)體系統(tǒng)、FoxO信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝等通路。研究[14]發(fā)現(xiàn)，肌肉損傷后使用重組趨化因子CCL5可促使補(bǔ)體系統(tǒng)C3a和C3aR信號(hào)表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)肌肉再生。FoxOs通路參與體內(nèi)眾多重要生物過(guò)程，如自噬、ROS解毒、DNA修復(fù)等[15-16]。學(xué)者[17]發(fā)現(xiàn)，抑制FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的激活，可緩解自噬、蛋白降解導(dǎo)致的神經(jīng)性肌肉萎縮。NINFALI C等[18]學(xué)者提出,ZEB1可抑制FoxO3轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制肌肉萎縮基因Fbxo32和Trim63啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。ABDULLAH M等[19]通過(guò)建立犬肌肉營(yíng)養(yǎng)不良模型發(fā)現(xiàn)，損傷后組織中膠原蛋白纖維化與肌肉萎縮在相關(guān)，而脯氨酸/精氨酸代謝途徑可能是炎癥相關(guān)膠原蛋白合成、肌纖維化的核心過(guò)程。

通過(guò)PPI分析及MCODE算法篩選出18個(gè)關(guān)鍵差異基因，其中部分基因已被報(bào)道與脊髓損傷后肌肉萎縮過(guò)程緊密相關(guān)。肌鈣蛋白在骨骼肌的收縮過(guò)程中起重要作用，脊髓損傷后肌肉組織內(nèi)源性肌漿網(wǎng)中 Ca2+含量降低約10%，與慢速骨骼肌型肌鈣蛋白I 1 (TNNI1)的表達(dá)相關(guān)，通過(guò)上調(diào)骨骼肌中 TNNI1的表達(dá)，可增強(qiáng)脊髓損傷者康復(fù)運(yùn)動(dòng)的抗疲勞性，改善疾病預(yù)后[20-22]。肌肉特異性糖原合酶1(GYS1)缺失可導(dǎo)致葡萄糖代謝功能和運(yùn)動(dòng)能力受損[23],促進(jìn)GYS1上調(diào)可提高肌肉收縮能力并減緩萎縮。補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)在神經(jīng)損傷區(qū)域被激活，保護(hù)神經(jīng)免受感染、緩解損害，其具體機(jī)制尚未闡明[24-25]。研究[26]證實(shí),C1q、C3、C5等補(bǔ)體在神經(jīng)損傷后可調(diào)控神經(jīng)再生。此外，肌源性轉(zhuǎn)錄因子MYOD1可協(xié)同E-box調(diào)控肌聯(lián)蛋白帽(TCAP),促進(jìn)對(duì)骨骼肌新陳代謝[27]。其余關(guān)鍵差異基因與肌肉萎縮的研究較匱乏，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

目前，治療脊髓損傷后肌肉萎縮的方法包括手術(shù)、藥物、基因工程等[28-31]。早期手術(shù)減壓可緩解組織繼發(fā)性缺氧、缺血，降低細(xì)胞損傷程度[32-33]。河豚毒素、苯妥英鈉等鈉通道阻滯劑可維持離子穩(wěn)態(tài)平衡，緩解軸突病變[34-35]。促紅細(xì)胞生成素上調(diào)SDF-1α與G蛋白偶聯(lián)的CXCR4受體等趨化因子的表達(dá)，可募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，增強(qiáng)組織抗凋亡能力，改善神經(jīng)功能等[36-37]。甲潑尼龍等激素可上調(diào)抗炎因子、降低組織氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕水腫等[38]。學(xué)者[39-41]提出，激素治療不僅在運(yùn)動(dòng)或神經(jīng)功能恢復(fù)上與對(duì)照組無(wú)明顯差異，還可能會(huì)加重感染、胃腸道出血等癥狀。胚胎干細(xì)胞移植和多能干細(xì)胞誘導(dǎo)可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，改變微環(huán)境，分泌營(yíng)養(yǎng)因子，使神經(jīng)再生[42-44]。

綜上所述，本研究所篩選出的差異基因在脊髓損傷病程中涉及微環(huán)境變化、神經(jīng)元變性壞死、肌肉組織纖維化、能量獲取、線粒體功能障礙等重要過(guò)程。臨床可對(duì)上述基因的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入研究，以為組織損傷后神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的生長(zhǎng)、代謝、凋亡等方面的治療提供理論依據(jù)，從而改善患者預(yù)后。